甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症患儿基因突变分析

王斐  韩连书  胡宇慧  杨艳玲  叶军  邱文娟  张雅芬  高晓岚  王瑜  顾学范上海新华医院儿童内分泌科韩连书

【摘要】 目的  检测甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症患儿的MMACHC基因突变类型及突变频率。方法  依据串联质谱检测血中的酰基肉碱、气相色谱-质谱检测尿甲基丙二酸、血清同型半胱氨酸测定及维生素B12负荷试验等进行诊断；应用聚合酶链反应（PCR）对这些患儿、部分直系亲属及健康对照组的MMACHC基因外显子进行扩增，通过DNA直接测序进行基因突变分析。结果  在28例患儿中27例检测到突变，共10种，其中2例仅检测到1个杂合突变，3例仅检测到多态性。突变集中在外显子3和4上（91.3%），以609G>A（W203X）最常见，突变频率为53.6%，其中10例为纯合突变，10例为杂合突变；其次为658_660delAAG（K220del），突变频率为8.9%，均为杂合突变。另外检测到6种未报道突变，分别为1A>G、365A>T、658_del660AAG、301-3_327del 30、567_568insT和625_626insT。3种基因多态性分别为-302T>G（rs3748643）、-234A>G（rs3728644）和321G>A（rs2275276）。结论  本研究结果揭示了中国甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症患儿的部分基因突变谱，其中609G>A（W203X）可能为热点突变。

【关键词】 甲基丙二酸；同型半胱氨酸；基因；突变

Analysis of gene mutations in Chinese patients with Methylmalonic acidemia and homocystinemia. WANG Fei, HAN Lian-shu, HU Yu-hui, YANG Yan-ling,YE Jun, QIU Wen-juan, ZHANG Ya-fen, GAO Xiao-lan, WANG Yu, GU Xue-fan. Department of Pediatric Endocrinology and Genetic Metabolism, Shanghai Institute for Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, China

Corresponding author: HAN Lian-shu（ Email: xhhanlianshu@Yahoo.com.cn）

【Abstract 】 Objective  Methylmalonic acidemia and homocystinemia, C type, is the most common inborn error of cobalamin metabolism. The gene MMACHC (OMIM 277400) is located on chromosome 1p34.1 with four coding exons and a 5th non-coding exon. It encodes for a protein with 282 amino acid residues. So far, more than 40 mutations have been detected, in which 271dupA(R91KfsX14) is the hot spot of MMACHC gene. However, there haven’t relative reports in China. The present study aimed to identify the mutation types of MMACHC gene and analyze the genotype-phenotype correlations in Chinese patients. Mothods  The diagnosis of this disease mainly depends on the measurement of C3 (propionylcarnitine),C3/C0(free carnitine) and C3/C2(acetylcarnitine) in the blood by tandem mass spectrometry, the detection of methylmalonic acid in the urine by gas-chromatography mass spectrometry, the determination of total homocysteine in the serum, and the loading test of vitamin B12. The entire coding region of MMACHC gene was screened by polymerase chain reaction (PCR) combined with DNA direct sequencing in 28 Chinese patients. Genomic DNA was extracted using Phenol-Chloroform method from the peripheral blood leukocytes of each patient. PCR amplification products were checked by 1.8% agarosegel electrophoresis and were subsequently sequenced with both the forward and reverse primers. Mutational analyses were performed using normal human genomic MMACHC sequence as a reference (GenBank ID: 25974). Results  In this study, ten mutations were identified in 27 of 28 Chinese patients. Most of them were located in exons 3 and 4(91.3%). We detected four mutations reported, which were 609G>A(W203X), 217C>T(R73X), 271dupA(R91KfsX14), and 394C>T(R132X), and six novel mutations, which were 1A>G, 365A>T, 658_660delAAG, 301-3_327del 30, 567_568insT, and 625_626insT. The 609G>A (W203X) is the most common mutation, which was detected in 30 of 56 alleles (53.6%), including 10 homozygote mutations and 10 heterozygote mutations. In addition, three gene polymorphisms were detected, namely, -302T>G (rs3748643), -234A>G(rs3728644), and 321G>A(rs2275276). These mutations include missense mutations, nonsense mutations, duplication, deletions, and insertions. Conclusion  In this study, we found a part of gene mutations spectrum in Chinese patients with methylmalonic acidemia and homocystinemia, in which the 609G>A(W203X) may be the hotspot mutation of MMACHC gene. This would help for the prenatal diagnosis and gene screening programs of methylmalonic acidemia and homocystinemia.

【Key words】 Methylmalonic acid; Homocystine; Gene; Mutation

甲基丙二酸血症(methylmalonic acidemia)是一种常染色体隐性遗传病，主要是由于甲基丙二酰辅酶A变位酶自身缺陷或其辅酶钴胺素(Cobalamin, cbl, VitB12)代谢缺陷所致。钴胺素代谢缺陷包括cb1A、cb1B、cb1C、cb1D、cb1E、cb1F、cb1G和cb1H 8种亚型，其中cb1C、cb1D和cb1F可同时导致辅酶脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素合成障碍，引起体内甲基丙二酸及同型半胱氨酸蓄积，故称为甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症。临床表现为神经、血液、肝脏、肾脏和皮肤等多系统损伤[1]。以C型常见，其编码基因为MMACHC (OMIM 277400)，定位于染色体1p34.1，含有5个外显子，cDNA有846 bp的开放读码框，编码282个氨基酸[2]，迄今为止，已报道40余种突变，国内尚未见相关报道。我们对2003年01月~2007年12月确诊为甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症的28例患儿进行MMACHC基因突变检测，报道如下。

对象和方法

一、对象

甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症患儿28例，14例来自本院，14例来自北京大学第一医院。患儿相互间无血缘关系，父母非近亲婚配。所有检查均获得患儿家长或监护人的知情同意。对照组为50例无血缘关系的非甲基丙二酸血症儿童。

二、方法

1.    诊断：（1）依据串联质谱检测患儿血中丙酰肉碱(propionylcarnitine, C3)、C3与游离肉碱（free carnitine, C0）比值和C3与乙酰肉碱(acetylcarnitine,C2)比值增高[3,4]；（2）气相色谱-质谱检测尿甲基丙二酸水平升高[5]；（3）血清同型半胱氨酸增高[6]；（4）VitB12负荷试验治疗有效[7]。同时对这些患儿进行血、尿常规、血气分析、血氨、血糖、血乳酸、肝肾功能和心肌酶谱测定、脑CT 或MRI扫描、脑电图、智测等辅助检查[6,7]。

2.    DNA提取：取患儿及部分患儿父母外周静脉血各4 ml，2%EDTA100μl抗凝，常规分离白细胞，采用苯酚-氯仿法提取DNA，－20°C保存。

3.    PCR扩增：设计MMACHC基因引物（表1），对其5个外显子、内含子及前侧翼区进行PCR扩增。PCR反应体系为50 ml，含10×buffer 5 ml，dNTPs 8 ml(1.25 mmol/L)，MgCl2 3 ml(25 mmol/L)，上下游引物(12.5 pmol/L)各2 ml，DNA模板约200 ng，Taq酶(Promaga公司) 2.5 U。在PCR仪上进行94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56~62 ℃退火30 s~1 min，72延伸30 s~1 min，循环32～35圈后72 ℃继续延伸5 min。1.8%的琼脂糖凝胶电泳鉴定目的PCR产物。

4.    DNA测序分析：PCR产物进行纯化后在ABI 3700测序仪上测序。应用Chromas软件分析测序图谱，结合GenBank（序列号：25974）人类MMACHC基因序列来识别患儿中的突变，并对照50例正常儿童的MMACHC相关位点基因测序结果，确定新突变及基因多态性。

5.    蛋白结构及同源氨基酸序列分析：根据Lerner-Ellis等[2]建立的MMACHC同源蛋白模型，对人类和其他种属的MMACHC同源序列进行比较，分析推测突变对蛋白结构功能的影响。

结  果

一、患儿临床资料及辅助检查

鉴于来自北京大学第一医院患儿的临床资料不全，故仅对本院14例患儿进行临床分析。其中11例患儿于1岁内起病，主要表现为喂养困难、反复呕吐、嗜睡、抽搐、智力落后、肌张力低下、精神运动发育迟缓，伴有巨幼红细胞性贫血、血小板或白细胞减少。3例患儿于1～4岁起病，表现为急性神经运动障碍，包括认知能力下降、意识模糊、运动功能倒退等。血串联质谱检测结果[中位数表示（范围）（对应参考值）]为C3：9.21（3.43～18.61）mmol/L （< 4. 0mmol/L ）；C3/C0：0.53（0.2～3.94）（<0.25）；C3/C2：1.2（0.41～2.06）（< 0.3）。尿气相色谱-质谱检测示甲基丙二酸水平（甲基丙二酸与内标17－烷酸的比值）为204.27（55.60～1032.82）（<1.1）。血清同型半胱氨酸平均为50 μmol/L（参考值5～15μmol/L）。其他检查示血红蛋白降低（13例），平均红细胞压积升高（9例），肝功异常（3例），尿微量蛋白增加（1例），提示轻度肾损伤，心肌酶谱异常（5例），部分患儿伴有酸中毒、尿酮体阳性、乳酸及血氨升高。颅脑MRI主要表现为脑萎缩、脑白质脱髓鞘病变及脑发育不全。7例患儿智测提示智力落后。11例患儿VitB12负荷试验后症状有明显改善。以上病例随访至今，2例早发型患儿于1岁内死亡。

二、MMACHC基因突变检测结果及突变频率分析

28例患儿的MMACHC基因突变测序分析（表2）示，等位基因突变检出率为82.1%（46/56）。27例患儿中检测到10种突变（图1～11），其中22 例检测到2个突变，检出率为78.6%（22/28），2例各检测到1个突变，3例仅检测到多态性，1例未检测出突变。突变集中在外显子3和4上，突变频率占91.3%（42/46）。在这10种突变中4种突变国外已报道，其中609G>A突变频率为53.6%（30/56），10例为基因纯合型，10例为杂合型；394C>T与609G>A以杂合型见于2例患儿；217C>T、609G>A 与271dupA、365A>T以杂合型分别见于1例患儿。另外6种突变未见报道，分别为1A>G、365A>T、658_660delAAG、301-3_327del 30、567_568insT和625_626insT，在50例正常对照组中未检测到这些突变。同时检测到3种基因多态性，即位于外显子1前侧翼序列中的-302T>G、-234A>G，以及外显子3上的一种同义突变321G>A（V107V）。参照PubMed中单核苷酸多态性数据库，证实分别为rs3748643、rs3728644和rs2275276，均为MMACHC基因多态性。

三、突变序列结构分析

人类MMACHC基因共编码282个氨基酸，根据MMACHC同源蛋白模型可知钴胺素结合区为残基122-156，MMACHC的C-末端为残基185-282跨越区，与TonB折叠有高度相似性。由此分析得出本研究中2种突变365A>T（H122L）及394C>T（R132X）位于钴胺素结合区；4种突变即567_568insT（I190?）、609G>A（W203X）、625_626insT（V209?）和658_660delAAG（K220del）则位于MMACHC的C-末端结构区。

讨  论

甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症是甲基丙二酸血症中最常见的一种类型，分为cb1C、cb1D和cb1F型，以cb1C型最常见。C、D或F缺陷一方面可造成维生素B12不能转化为脱氧腺苷钴胺素，继而使线粒体内甲基丙二酰辅酶A变位酶活性下降，引起甲基丙二酸大量堆积，导致甲基丙二酸血症；另一方面使维生素B12不能转换成甲基钴胺素，使蛋氨酸合成酶活性下降，引起体内同型半胱氨酸蓄积，伴巨幼红细胞性贫血。早发型患儿多在1岁内起病，以神经系统症状为主，常伴发血液系统及胃肠道功能障碍。迟发型患儿可在1岁后起病，常合并脑、外周神经、肝、肾、眼及血管等多系统损害，运动障碍表现突出[8-10]。近年来随着串联质谱和气相色谱-质谱技术的应用，提高了甲基丙二酸血症诊断率，许多患儿得到及时诊断。本院14例患儿主要表现为呕吐、纳差、抽搐、贫血、智力落后、四肢肌力低下及生长发育迟缓，体内甲基丙二酸及同型半胱氨酸明显蓄积。部分患儿合并巨幼红细胞性贫血、代谢性酸中毒、肝肾功能及心肌酶谱异常。颅脑MRI主要表现不同程度的脑萎缩及发育不全，智测示智力低下，脑电图示惊厥发作，均为脑损伤征象[11]。患儿对VitB12治疗均有效。随访至今，除2例早发型患儿死亡外，其余患儿病情明显好转。

近几年国外已开展有关MMACHC基因型的研究。Lerner-Ellis等[2]通过对250例cb1C 型患者的基因突变研究，检测到42种突变及24种基因多态性。271dupA（R91KfsX14）突变频率达40%，主要见于欧洲人；217C>T杂合突变见于6例患者；394C>T位于热点CG岛中，主要以纯合型见于11例印第安、巴基斯坦或中东患者；609G>A纯合突变见于5例东亚患者。我们在28例患儿中也发现以上4种突变，其中609G>A突变频率为53.6%，提示为中国人群的热点突变。这4种突变在氨基酸翻译过程中都有提前终止的作用，271dupA突变导致从第91位精氨酸发生移码，在第105位密码子处提前终止[12]；217C>T、394C>T和609G>A为3种无义突变，可造成第73、132位的精氨酸及第203位的色氨酸翻译提前终止。本研究发现的6种新突变均为杂合突变，以658_660delAAG较多见，造成蛋白质翻译时第220位赖氨酸缺失；1A>G使第1位蛋氨酸变为缬氨酸，此位点有报道突变1A>T，氨基酸改变尚未确定[2]；365A>T则可使第122位组氨酸突变为亮氨酸，此位点有报道为365A>G，即组氨酸变为精氨酸[2]；301-3_327del30为30个碱基片段的缺失，造成部分内含子缺失及第93位丝氨酸到101位异亮氨酸9个氨基酸缺失；567_568insT、625_626insT分别造成从第190位异亮氨酸及209位缬氨酸开始发生移码突变。这几种新突变需要通过体外表达来进一步证实。本研究中检测到3种基因多态性，其中-302T>G 及-234A>G均位于前侧翼区，可能对基因调控起作用。3例患儿仅检测到多态性，可能由于突变发生在剪切或上游调控区中，故未检测到突变。综上所述，突变位点主要集中于外显子3及外显子4序列中，故可优先对这两个外显子区进行基因筛查。

通过MMACHC蛋白结构分析可知，钴胺素结合区为122-HXXGX126-154GG-156，C-末端结构（残基185-282）为一个非连续的β-折叠以及12个残基形成的α-螺旋，与TonB存在结构功能相似性。突变271dupA（R91KfsX14）及217C>T（R73X）使翻译在钴胺素结合区之前终止，365A>T（H122L）及394C>T（R132X）则位于钴胺素结合区，都可影响钴胺素的结合；突变301-3_327del30是发生在C-末端结构之前的移码突变，567_568insT（I190?）、609G>A（W203X）、625_626insT（V209?）与658_660delAAG（K220del）则位于MMACHC的C-末端结构区中，均可能影响钴胺素转运所需的质子泵能量转化。根据MMACHC蛋白同源序列分析可知，突变365A>T、394C>T、567_568insT、625_626insT及658_660delAAG除影响以上功能结构区外，也位于同源序列的高度保守区，提示对蛋白功能的影响作用较大；而1A>G突变虽然未发生在功能结构区，但位于高度保守区，仍可能对蛋白功能有重要影响。此外，研究认为MMACHC基因突变也可能直接或间接影响钴胺素中心钴原子的还原及上游轴向配体的清除，继而影响细胞内钴胺素的运输[2]。

近来对MMACHC基因型与临床表现型的研究认为两者存在一定的关系。汇总以往的报道，在282例cb1C型患者中有69例为271dupA纯合型，其中66例为早发型；394C>T是另一种常见突变，17例患者为纯合型，其中16例为迟发型，26例患者为杂合型，其中14例早发，12例迟发[2,12-14]。本研究中突变频率较高的609G>A突变的纯合型及杂合型在早发型和迟发型患儿中均检测到，271dupA及394C>T分别仅见于1例患儿，故尚不能明确突变基因型与表现型之间的关系。1例患儿未检测到突变，疑为继发性维生素B12缺乏症。

综上所述，本研究表明609G>A为中国甲基丙二酸血症伴同型半胱氨酸血症患儿的热点突变，并检测到6种国内外尚未报道的突变。这些突变的检出有助于建立基因诊断筛查系统，并可进行携带者的检测及先证者家系的产前诊断[15]。至于这些突变对蛋白功能和酶活性的影响，以及基因型与临床表现型之间的关系尚有待进一步研究。 

参  考  文  献

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表1   MMACHC 基因PCR引物序列

外显子

正向引物（5'-3'）

反向引物（5'-3'）

片段大小(bp)

Exon 1

GGGATACCGTGATGATACGC

GAACCCAGGAGGATCAGAGG

680

Exon 2

TGCATCACATAGCGTCAGTG

AGCCTGGCTTTAGGGTATCA

467

Exon 3

TCATGTTTTCCCTTCTGAGGA

CAAAGCTAATTTGTTCTGGGTTG

395

Exon 4a

AGGCCTAGCTTGCAATGATG

GAAGGCAGATGGGAATTCTG

694

Exon 4b

TTTGGCAAAGCAAAAGGTT

CAAGATGGGTGGATCACGA

395

Exon 5a

AGCCTGGCCAATACAGTGAA

AGCCTTCCCTTGGTTCTAGC

689

Exon 5b

ACCATTTTGGGAGGCTGAG

GGGCAGGCTACTGGTTTGTA

666