对于获得性再生障碍性贫血（aplastic anemia, 再障），目前趋同认为再障是免疫介导的造血功能衰竭症，造血干/祖细胞显著减少，从而导致难治性血细胞减少。随着治疗对再障预后的改善，发现部分再障会出现克隆性疾病转化，比如阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）、骨髓增生异常综合征（MDS），甚至急性髓系白血病（AML）。近年来，随着二代测序技术逐渐用于临床，许多结果显示再障存在着克隆性造血，但是这些克隆性造血的性质，由来以及转归尚待解读。南京医科大学第一附属医院血液内科何广胜

　　再生障碍性贫血伴有克隆造血？

　　再障是可以伴有克隆性造血的，比如PNH克隆，这是一个后天获得性体细胞突变引发疾病。PNH患者可以逐渐发生再障，而再障也会逐渐出现PNH克隆，两个疾病存在密切的关联[1]。随着高敏流式细胞技术应用，发现许多再障存在PNH小克隆，并且与免疫抑制治疗反应有关[2]。细胞遗传学和染色体6p单亲二倍体检测也显示存在克隆性造血，但是这些常常异常是变化，且并不一定与MDS或者AML关联[3,4]。

　　确立再障的诊断是要排除克隆性疾病，而再障又会发生克隆性疾病，那么这些克隆是再障发病时即伴有，还是疾病发生发展过程中获得的？对于再障造血细胞进行深度的二代测序，并体细胞对照，逐渐显现了此过程。

　　Kulasekararaj等[5]对57例再障进行835个与造血功能衰竭或髓系肿瘤相关的体细胞突变基因进行筛查（鉴于PNH与再障的密切关联性，作者排除了PIGA基因），随后在93例患者中验证。29例（19%）发现有基因突变，累及ASXL1（12例）、DNMT3A（8例）、BCOR（6例），还有TET2、MPL、SRSF2、U2AF、IKZF1和ERBB2均1例。突变的中位等位基因负荷是20%（1.5%~68%），11例患者突变为小负荷（＜10%），主要见于DNMT3A（5例）、ASXL1（3例）、BCOR（2例）和TET2（1例）。伴有突变的再障病程更长 (37月 vs 8 月, P＜0.04)，而小负荷突变亦主要在病程较短（<6月）的再障患者中，提示再障病程长易发生突变，且负荷会增高。

　　Babusshok等[6]对22例获得性再障配对了骨髓和皮肤样本，比较全外显子组测序结果，发现16例（72.7%）存在有体细胞突变，12例（66.7%）是小儿发病的患者。51基因中发现了58个突变，主要涉及的是免疫和转录途径的调控。最常见的是PIGA基因突变，而与MDS的相关突变仅见2个。作者认为再障的克隆性造血在发病时即存在了，可能需要对再障造血状态再认识。

　　再生障碍性贫血伴有的克隆造血是什么性质？

　　Yoshizato等[7]对439例再障的668份标本行全外显子测序，其中82例进行了系列标本研究。在156例患者（36%）中发现了249个基因突变，其中56例（36%）有多个突变。最常见的突变基因是BCOR和BCORL1（9.3%），PIGA（7.5%），DNMT3A（8.4%），和ASXL1（6.2%）)。BCOR/BCORL1和PIGA的突变频度和突变数与年龄没有关系。但是全部的，或者不包含BCOR/BCORL1和PIGA的基因，其突变频度和突变数均随着年龄而显著增高。这是与人群中获得的测序结果相类似[8]。

　　45例再障在免疫抑制治疗前发现的79个突变，治疗后6个月随访，其中58个突变的等位基因频度显著升高，但基因突变的次数前后没有差别。

　　虽然再障中发现了一些与MDS和AML相关的基因突变，但是再障中突变基因的平均等位基因负荷远低于MDS（9.3% vs 30.4%）。DNMT3A和ASXL1在AML、MDS和再障均是常见的突变基因，但是再障同时有BCOR/BCORL1和PIGA的高突变率，且另外一些突变基因，如TET2、剪接子复合物基因、JAK2、RUNX1、和TP53的低突变比率，说明再障存在着与MDS不同的克隆选择离散机制。

　　再生障碍性贫血克隆性造血与预后相关性

　　同Kulasekararaj等[5]的结果类似，NIH对于重型再障免疫抑制治疗6个月后结果判断，突变有否，不影响免疫抑制治疗再障的效果。同样，在总体生存率和疾病进展率（转为MDS和AML），有否突变无影响。

　　但是单因素和Logistic回归分析显示，BCOR/BCORL1突变是良好反应的独立预后指标（P=0.013）。对突变基因分层发现，BCOR/BCORL1和PIGA突变是良好反应组；不良突变组最差（包括ASXL1、DNMT3A、TP53、RUNX1、JAK2、JAK3和CSMD1）；无突变组居中。相应地，在总生存率和疾病进展率上，BCOR/BCORL1和PIGA突变组和不良突变组（包括ASXL1、DNMT3A、TP53、RUNX1、JAK2、JAK3和CSMD1）分别较无突变组更佳或更差。鉴于年龄在预后上有重要影响，进一步采用Cox 风险回归模型分析，显示良好体细胞突变与较佳生存率有关，而不好的体细胞突变，以及大龄、男性和较低初始网织红细胞数与较差生存率相关。年轻患者中，总生存率更是特别地受不良突变影响。

　　连续地系统测序进行克隆结构分析显示，BCOR/BCORL1和PIGA突变克隆趋于稳定或者消失，对免疫抑制治疗有良好反应；相对应，伴DNMT3A、ASXL1，和其他一些基因突变的克隆随着时间更易扩增，并衍生新的亚克隆，乃至亚亚克隆，对免疫抑制治疗反应差，生存率低，易于转化为MDS或AML。

　　健康人群年龄配对研究显示，再障的基因突变也呈年龄相关。与健康人群一样，再障在mCpG岛甲基化胞嘧啶（mC）特发转化为胸腺嘧啶核苷最为常见[9]。突变多为低等位基因负荷，主要是发生髓系肿瘤突变，但再障突变中BCOR/BCORL1和PIGA更多，而TET2和JAK2较少，显示再障与健康人群在造血克隆选择上存在自身特点。当然，再障造血克隆衍生和转化，还会与其他途径相关，比如端粒。

　　再生障碍性贫血克隆性造血的解读

　　首先需要进行体细胞突变检测验证，不然，无法确认是造血细胞获得性突变。突变基因要评价其突变频度和等位基因负荷量，最好能进行持续监控。因为基因突变高度变度，可能扩增、稳定，甚至消失。人群年龄配对分析也非常重要。

　　最后虽然突变基因有其相应功能，但是不能说有此突变的细胞就一定会发生相应细胞生物学改变。含此突变基因克隆在造血功能衰竭炎症微环境中，同时经历着年龄老化的选择，生物学后果往往会复杂。

　　总之，深度测序为造血系统疾病，尤其是再障这样的造血功能衰竭症――细胞少，取材差，不易研究，提供了好的手段。紧密结合患者的临床特点，详细分析与治疗反应和预后的关联性，将为再障的诊断、分型和治疗给出精准指导。