鼻咽癌细胞系SUNE中EBV-LMP1基因对永生化人胚肾上皮细胞生长特性的影响

　　我们发现，(s)lmp1及(b)lmp1基因转染的上皮细胞均生长旺盛，失去接触抑制，细胞堆积生长，在软琼脂中能够形成多个细胞集落。说明(s)lmp1及(b)lmp1基因均能明显改变上皮细胞的生物学行为，促进细胞的生长、增殖和转化，使转染的上皮细胞获得肿瘤细胞的生长特征。这两种不同来源的lmp1基因，在体外对上皮细胞的转化功能似乎并无差别。为了比较这两种lmp1基因在有机体内的功能, 我们用(s)lmp1-293及(b)lmp1-293细胞分别接种于裸鼠皮下, 发现(s)lmp1单独即可引起裸鼠成瘤(2/5)，加上tpa处理，可提高其致瘤能力(4/5)；而(b)lmp1单独作用不能致瘤(0/5)，但与tpa协同作用则可引起肿瘤(2/5)。此结果与li等［9］的报道相似。我们推测，尽管两种不同来源的lmp1在体外具有同等细胞转化能力，但进入动物体内后，不同来源的lmp1有可能因为其结构上的某些差异而造成它们在体内的表达情况不同，进而影响到它们致瘤能力的不同。本研究结果提示，来自sune细胞的lmp1基因，似乎比来自b95-8细胞的lmp1基因，具有更强的致瘤性。虽然由于各组接种例数较少，尚不能下此结论，但我们认为，它将有可能揭示ebv的普遍感染与npc的相对少发以及npc的地区性分布等矛盾现象的原因所在，值得深入研究。

　　尽管lmp1在npc发生、发展中的作用已经受到学者们的关注，但以往关于lmp1的研究资料大多来自于原型株b95-8细胞， 而对npc组织中lmp1的研究近年才有所报道。学者已经检测了来自中国上海的npc细胞系cao株［1］、来自台湾的npc活检组织［7］及来自非洲npc的c15株［8］中lmp1基因序列, 发现与b95-8细胞的ebv原型株相比，虽保留了原型株的基本结构, 但均存在有一定的变异，不同地域来源及不同分化程度的npc组织之间，在lmp1基因序列上有所不同［1～3,7］。已知ebv在人群普遍易感且可终生携带，而npc只发生于极少数人，并有明显的地域性，东南亚国家npc的发病率比欧美国家高100倍, 且恶性程度较高。这种现象使我们想到，是否由于某些特定地域或特定人群所感染的ebv-lmp1基因有所变异并导致其功能改变，从而促成这些地域或人群罹患npc的危险性增加。因而我们对来自npc高发区中国广东的npc细胞系sune中的lmp1基因与原型株b95-8细胞中的lmp1基因，在影响细胞生长特性方面作了多项指标的比较。

讨论

　　6．转染细胞在裸鼠体内的成瘤性：细胞接种后第24天, 发现在(s)lmp1-293+tpa及(b)lmp1-293+tpa处理组中，各有1只裸鼠在接种部位出现肉眼可见的肿瘤, 此后, 在lmp1转染细胞接种组中陆续有肿瘤形成, 而空载体转染和未转染细胞接种组未见肿瘤形成。至接种后第32天, 共有8只裸鼠出现肿瘤, 继续观察58～72天, 未再有新的肿瘤形成。

图2　细胞生长曲线

　　5. 软琼脂集落形成能力: 培养7天左右，即可见lmp1转染细胞形成多个集落,至14天时集落明显增大，集落数目增多(图3)；而v-293及未转染的293细胞仅偶见个别较小集落, 且在早期即停止生长。

　　4. 细胞生长曲线: 由图2可见, lmp1基因转染细胞的生长速度，明显高于空载体转染及未转染细胞。

　　3. 培养细胞生长状态的动态观察: 分别用106个(s)lmp1-293、(b)lmp1-293、v-293及未转染的293细胞接种于25 cm2培养瓶中，静置培养，倒置相差显微镜下观察，发现4种细胞形态无明显差异，但生长速度及方式有明显不同。v-293及未转染的293细胞在培养至48小时时，细胞呈单层；至72小时细胞开始死亡、脱落(图1a)。而lmp1基因转染的293细胞培养至48小时时呈密集单层；至72小时，细胞不见脱落，仍然呈现增殖旺盛，失去接触抑制，细胞堆集生长；至96小时时，细胞可堆集成“岛屿状”(图1b)。

　　2. 转染细胞中lmp1蛋白的表达: 免疫组化染色显示, (s)lmp1-293、(b)lmp1-293细胞均呈阳性反应, lmp1主要分布于胞浆及膜上, 而v-293细胞及未转染293细胞均为阴性。

　　1.重组质粒转染293细胞抗性克隆的建立:重组质粒pcdna3-(s)lmp1、pcdna3-(b)lmp1及空白载体pcdna3 分别导入293细胞，经g418选择培养, 10天后抗性细胞克隆出现，表明转染成功。转染后的293细胞分别命名为(s)lmp1-293、(b)lmp1-293及v-293细胞。

结果

　　6.转染细胞在裸鼠体内的成瘤实验:分别用0.2 ml(每毫升浓度为2×107个活细胞)的(s)lmp1-293、(b)lmp1-293、v-293及未转染的293细胞接种于裸鼠皮下，每种细胞均设单纯细胞接种组及细胞接种加tpa(12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate)处理组，后者每只用tpa50 ng，注射于细胞接种部位, 每周1次, 连续5周。每组接种5只裸鼠。

　　5.软琼脂细胞集落形成试验:在6孔细胞培养板中，每孔先加0.5%的下层琼脂培养液3 ml，冷至凝固后, 每孔再加0.33%的含5×104个细胞的顶层琼脂2 ml，置湿盒, 于37℃、co2孵箱培养并观察14天。

　　4.细胞生长曲线的绘制:将浓度为5×104/ml的细胞悬液接种于15个小方瓶，每瓶2 ml，置37℃、5% co2孵箱培养。自48小时后，每天取出3瓶进行活细胞计数, 取3瓶细胞的均数绘制细胞生长曲线。

　　3.转染细胞中lmp1蛋白的检测:采用免疫组化染色。用ebv-lmp1单克隆抗体(cs1～4，由英国伯明翰大学肿瘤研究所惠赠)，按lsab试剂盒(dako公司产品)说明书操作。

　　2. 真核细胞表达质粒转染永生化人胚肾上皮细胞(293细胞)：293细胞由预防医学科学院曾毅院士惠赠。用lipofectin reagent(gibco公司产品)按产品说明书将质粒dna转染入293细胞, 传代于含200 μg/ml g418的选择培养液中，直到抗性细胞克隆形成。

　　1. ebv-lmp1基因真核表达质粒pcdna3-(s)lmp1及pcdna3-(b)lmp1:由本室制备。根据gene bank公布的ebv基因序列，利用oligo引物分析软件，电脑辅助设计一对引物,用长片段dna pcr扩增试剂盒(expandtm high fidelity pcr system, boehringer mannheim公司产品)，分别从sune细胞及b95-8细胞(本室保存)dna中扩增出lmp1全基因，其位置相当于ebv基因组上的166 608～170 033nt，包括lmp1基因的上游调控序列、lmp1编码序列的三个外显子、两个内含子及下游polya信号序列。先将该片段连接于puc18载体的bam hi位点,再定向亚克隆于真核细胞表达载体pcdna3。由sune细胞来源的lmp1基因及由b95-8细胞来源的lmp1基因所建立的真核表达质粒，分别命名为pcdna3-(s)lmp1及pcdna3-(b)lmp1。

材料与方法

　　鼻咽癌(npc)与eb病毒(epstein-barr virus,ebv)密切相关。ebv潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,lmp1)是npc组织中表达的与细胞转化有关的蛋白［1］,lmp1基因已被认为是病毒的一种癌基因。以往对lmp1的研究资料大多来自于ebv原型株b95-8细胞，近年来学者们已开始关注npc组织中的lmp1的研究,并已发现不同地域来源、不同分化程度的npc组织中，lmp1基因结构与功能似乎存在一定差异［2,3］。中国广东省为世界上npc的最高发区，中山医科大学肿瘤研究所建立了来自广东省患者的npc体外传代细胞系sune。多项实验证明，该细胞携带有ebv, 我们从sune中扩增出ebv-lmp1全基因,并以b95-8细胞中lmp1为对照,同时建立了该基因的真核表达质粒。关于ebv-lmp1对b淋巴细胞的转化作用，已有较多研究［4～6］，但关于lmp1对上皮细胞的影响，认识尚浅。npc为上皮细胞来源的肿瘤，深入研究lmp1对上皮细胞的作用，将有助于探讨lmp1与npc的关系。我们用lmp1基因真核表达质粒转染到人胚肾上皮细胞,观察lmp1基因对上皮细胞生长特性的影响，以探索lmp1在npc发生中所起的作用。

　　【subject words】　nasopharyngeal neoplasms　　epstein-barr virus　　latent numbrane protein 1 geneepithelial cell

　　【abstract】　objective　to study the effect of ebv latent membrane protein (lmp1) gene isolated from human nasopharyngeal carcinoma cell line sune on the growth of epithelial cells and the role of lmp1 in the genesis of nasopharyngeal carcinomas. methods　ebv lmp1 gene eukaryotic expression plasmid was transfected into human embryo kidney epitheial cells. expression of lmp1 protein in the transfected cells was detected. dynamic cell growth status, growth rate, ability of colony formation in soft agar and the tumorigenicity of the transfected cells in nude mice were studied. results　the lmp1 gene transfected cells grew vigorously and rapidly, lost contact inhibition, formed more colonies in soft agar, developed tumors in nude mice. conclusionlmp1 gene could alter the biological behaviours of epithelial cells, promote cell proliferation and transformation, and endows the transfected cells with growth characteristics like tumor cells.

　　effect of ebv latent membrane protein 1 gene isolated from human nasopharyngeal carcinoma cell line sune on the growth of immortalized epithelial cells　　chen yifang, guo huiyu, wang huimin, et al. sun yat-sen memorial hospital, sun yat-sen university of medical sciences, guangzhou 510120

　【摘要】　目的　研究鼻咽癌细胞系sune中eb病毒潜伏膜蛋白1(lmp1)基因对上皮细胞生长特性的影响, 探索lmp1在鼻咽癌发生中所起的作用。方法　用lmp1基因真核表达质粒转染人胚肾上皮细胞, 检测lmp1的表达,观察细胞的生长状态、生长速度、在软琼脂中的集落形成能力及对裸鼠的致瘤能力。结果　被lmp1基因转染的细胞生长旺盛,丧失接触抑制,生长速度增快,在软琼脂中能够形成多个集落，并能在裸鼠体内成瘤。结论　lmp1基因能明显改变上皮细胞的生物学行为，促进细胞的生长、增殖和转化，使转染的上皮细胞获得肿瘤细胞的生长特征。

中华肿瘤杂志 1998年第5期第0卷 基础研究

    鼻咽癌细胞系sune中ebv-lmp1基因对永生化人胚肾上皮细胞生长特性的影响