血友病的基因治疗

　　血友病是一种遗传性出血性疾病，发病原因是由于患者的血液中先天缺乏某种因子，根据缺乏因子的不同分为三种类型：血友病A(缺乏FⅧ，又称血友病甲)、血友病B(缺乏Ⅸ，又称血友病乙)和血友病C(缺乏FXI)。血友病甲和血友病乙均属X性联隐性遗传，一般由女性传递，男性发病。血友病C较少见，为常染色体不完全隐性遗传，男女均可发病。通常所说的血友病是指血友病A。

　　1发病原因——基因与基因突变

　　在所有的血友病家系中，50%-60%为无家族史的散发家系，其原因主要为存在新生突变或体细胞嵌合[川。人类基因突变数据库(thehumangenemuta—tiondatabaSe网站http//www.uwcm.acuLuw~l/mg/hgmdo.hun1)统计表明，血友病A、B基因突变主要有基因重组、点突变、缺失和插入等种类。血友病A，FⅧ基因位于x染色体长臂远端(Xq28)，全长186kb;含26个外显子(占总长的5)和25个内含子(占总长度的95)，cDNA长9kb，其前体编码2351个氨基酸。由该基因编码的FⅧ为单链糖蛋白，含2332个氨基酸，包括两种不同的分子内同源区：A区和C区。氨基酸序列分析表明，FⅧ由3个A区(每区330-~380个氨基酸)、1个B区(980个氨基酸)、2个C区(每区约150个氨基酸)构成。22号内含子是FⅧ基因中最大的内含子，它所包含的FⅧ相关基因A(F8A)与重型血友病的发生有关。

　　血友病B，FⅨ(hFⅨ)基因位于x染色体长臂远端，定位于Xq27.1区带，靠近脆性x位点而远离Ⅷ因子位点，整个基因共有34kb，由8个外显子和7个内含子组成，反转录DNA(cDNA)约2.8kb，其中编码区长.1.4kb。在凝血串激反应中，FⅨ具有重要作用。在遗传过程中，受FⅨ基因编码的影响，在表达过程中，其产物要经过一系列翻译后修饰，包括：门冬氨酸(Ash)残基加唾液酸，维生素K的谷氨酸7一羧基化，和第64残基的门冬氨酸j}羧7基化，其中羧基化为凝血活性所必需。

　　2血友病的基因诊断

　　2.1直接基因诊断采用分子生物学方法(P(，DGGE，SSCP，DNA测序等)直接测定致病基因的缺陷。FⅧ22内含子倒位分析可作为重型HA的筛选试验，也是目前唯一用于临床诊断的直接基因检测方法。FⅧ22内含子倒位和其它一些基因突变常伴有抑制物发生，因此有助于预测抑制物的产生。

　　2.2间接基因诊断利用致病基因内外的限制性片段长度多态性(RFLP)作为特异分子遗传标志物，通过家系成员问的连锁关系确定血友病基因的遗传情况进行DNA多态性分析的遗传学诊断(RFLP，VNTR，STR等方法)，可使诊断率达99。RFLP分析的局限性：必须具有先证者的标本;母亲系该多态位点杂合子，联合多个RFLP才可诊断。

　　2.3产前诊断对高危胎儿可在妊9～12周通过绒毛膜活检;妊12～16周进行羊水穿刺诊断;妊18～2O周可在胎儿镜下取脐静脉血诊断。上述方法都存在流产的危险(约0.5～1)，需在妇产科医生的指导与配合下进行。利用流式细胞术(FACS)测定母体静脉血中的胎儿特异性单克隆抗体以确定胎儿性别，提供了早期、无创性产前诊断的方法。

　　3基因治疗

　　血友病的传统治疗方法为静脉输入纯化的FⅧ，虽然可以有效纠正临床症状，但有感染人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒等危险[2]。因此，基因治疗血友病是一种有效的可供选择的治疗手段。.

　　3.1重组FⅧ浓缩物(rFⅧ)通过基因克隆技术表达，1990年通过美国FDA批准，其生物活性，半寿期与血浆FⅧ相似，安全，无病毒污染，钽价格昂贵，也可产生抗体。目前在加拿大与爱尔兰几乎所有血友病患者，美国7O以上重型HA采用rFⅧ治疗。第二代rFⅧ(BDD)：利用蔗糖代替蛋白作为稳定剂，FⅧ无B区，但仍保留其活性，生化特性基本同血浆制品。由于不含其他人类蛋白，无免疫活性，更安全，有效。第三代rFⅧ：利用鼠单抗，不含人和动物蛋白，尚处临床试验阶段。未来若干年内，转基因方法生产的人血浆制品的产量将大幅度提高，有望满足全世界血友病患者的需要。

　　3.2病毒介导基因转移法

　　3.2.1反转录病毒载体(RV)：反转录病毒最大优点是能将外源性基因稳定地整合到宿主细胞基因组中，使基因获碍长期稳定表达，是血友病基因治疗的常用载体之一。在反转录病毒改造方案方面，莫洛尼小鼠白血病病毒含内含子的MFG载体系统的应用增加了可感染细胞的种类、病毒滴度和FⅧ、FⅨ表达水平。加入5一内含子的反转录病毒载体GC-samF8EN可感染多种细胞，Dwarki等l_4]用其感染人原代皮肤成纤维细胞，与胶原基质、聚四氟乙烯纤维混合后共同植入严重联合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficentdisease，SCID)小鼠，其后在小鼠血浆中测得较高水平的FⅧ、FⅨ。但反转录病毒的基因转移系统存在如病毒滴度较低、可感染的宿主范围较小易被血清补体灭活、不能感染静止细胞等缺点，限制了反转录病毒在基因治疗领域的进一步应用。近年人们发现以口腔炎疱疹病毒一G[](VSV-G)的蛋白可以代替传统的双嗜性病毒的囊膜来包装反转录病毒，由此产生编号为VSV-G的假型病毒载体具有诸多优点l_7]：(1)病毒滴度高，经浓缩可达10。efu/ml;(2)宿主范围广转染效率高;(3)能抵抗血清抗体灭活作用，为反转录病毒在基因治疗领域注入新的活力。反转录病毒载体的缺点在于只感染分裂期细胞，并且有致突变的危险。

　　3.2.2腺病毒载体(AV)：腺病毒载体感染宿主细胞广泛，感染效率高，可以有效地转染肝脏，是血友病基因治疗中应用较广泛的病毒载体之一。Kay首次证实了应用AV，血友病狗能高水平表达FⅧ和FⅨ。将纯化的单一mini-AdFⅧ经静脉注入血友病A小鼠体内，获得了长期表达的胜利水平(100～800ng/m1)的FⅧl_8]。应用高能腺病毒载体(HCAd)在SCID小鼠模型体内产生了超生理水平的FⅧ和FⅨl_9]，且副作用小。腺病毒载体的缺点是机体对其病毒蛋白易产生免疫反应。

　　3.2.3腺相关病毒载体(AAV)：AAV是感染缺陷性的单链NA小病毒，不与任何已知的人类疾病相关，具有可整合于靶细胞基因组、无载体免疫原性和无致病危险的特点。实验表明，AAV能指导转基因在肌肉、肝脏和中枢神经系统的表达。Chao等。]将包含有疱疹PK启动子的AAWBDDFⅧcDNA注入SCID小鼠体内后，FⅧ水平达6~10ng/ml;注射2周后出现hFⅧ抗体，但在lO个月后抗体消失，FⅧ表达量达58ng/ml，表达时间达l8月之久。Nakai门静脉注射EFla启动子的重组AAV也得到高水平的FIX表达。最近陆华中等采取定点诱变技术获得了高活性的人FⅨ突变衍生物基因，并利用一个新的AAV制备系统，FIX获得了较高水平的表达和一定时间内的治疗效果。AAV载体的缺点是纯化困难，包装容量小，有致癌的危险。

　　4靶细胞

　　这里所指的靶细胞是指接受转移基因的体细胞。选择靶细胞的原则是：(1)必须较坚固，能耐受处理易于由人体分离和回输;(2)具有增殖优势，生命周期长;(3)易于受外源遗传物质的转化;(4)选用反转录病毒载体时，目的基因表达最好具有组织特异性的细胞。目前使用较多的是骨髓干细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肌细胞等