慢性乙型肝炎患者精子中乙型肝炎病毒DNA定位

　　国内外学者曾用斑点杂交和Southern印迹杂交法检测精液中乙型肝炎病毒（HBV） DNA的存在［1，2］。为从形态上明确HBV DNA是否存在于男性慢性乙型肝炎患者成熟精子中及其分布情况，我们采用原位杂交法检测了22例慢性乙型肝炎患者精子中HBV DNA。

　　一、材料与方法

　　1．标本收集：精液采自1990～1993年华西医科大学附属第一医院22例男性慢性乙型肝炎患者，HBsAg、HBeAg均为阳性，年龄19～25岁。为保持精子新鲜，采集后的标本尽快进行实验。

　　2．试剂：Digoxigenin试剂盒购自西德Boehringer Mannherm公司。Dig-HBV DNA探针由华西医科大学肝炎研究室制备。

　　3．方法：先按常规方法对22例精液标本行HBV DNA斑点杂交，再将精液标本用PBS缓冲液反复洗涤，分离去除精浆成分,斑点杂交法检测末次洗涤液HBV DNA，结果阴性后留置精子悬液，各取5 μl精子悬液均匀涂布于经多聚赖氨酸处理过的玻片上，丙酮固定后蒸汽浴变性，与Dig-HBV DNA探针杂交，过夜，漂洗后用氮蓝四唑（NBT）显色，终止显色反应后甲基绿衬染，封片。杂交时设置阳性对照，阴性对照和不加探针自身空白对照。杂交方法参照文献［4］。

　　二、结果

　　22例男性慢性乙型肝炎患者精液DNA抽提物经斑点杂交检测，结果有14例阳性。 将22例经彻底洗去精浆后的精细胞标本行原位杂交，其中2例HBV DNA阳性。此2例经斑点杂交检测HBV DNA也为阳性。原位杂交阳性标本，镜下显示HBV DNA均位于精子头的膜部和核心部，未见位于顶、体部者。 对照组无此现象。

图1　精子细胞膜、核心部呈阳性反应　原位杂交　×100

　　三、讨论

　　母婴垂直传播是HBV感染的传播途径之一，但尚未见明确的依据证实HBV父婴垂直传播。Blumberg［3］曾推测HBV DNA可能整合于宿主生殖细胞基因中然后在子代中传播。1985年Hadchouel等［1］用斑点杂交和Southern印迹杂交检测9例乙型肝炎患者精液，发现2例HBV DNA阳性。徐小元等［2］也用此方法检测了慢性乙型肝炎患者精子中HBV DNA的存在。此种检测法证实了精液中确实存在HBV DNA，但不能从形态上定位观察HBV DNA在精子中的存在和分布情况。原位杂交法则弥补了上述不足。我们在精子头的膜部和核心部发现了HBV DNA，从形态上明确了HBV DNA在慢性乙型肝炎患者成熟精子中的分布，为HBV父婴垂直传播提供了可能的证据，有助于进一步研究HBV DNA经生殖细胞传递给子代的可能性［5］。

　　基金项目：国家自然科学基金(38970047)和美国纽约中华医学基金会(CMB)资助项目

　　参考文献：

　　［1］Hadchouel M, Scotto J, Huret JL,et al. Presence of HBV DNA in spermatozoa : a possible vertical transmission of HBV via germ line. J Med Virol,1985,16:61-66.

　　［2］徐小元，刘逢举，田庚善，等. 慢性HBV感染者精子中HBV DNA 存在的初步报告. 兰州医学院学报，1987，1:1-4.

　　［3］Blumberg BS. Australia antigen and biology of hepatits B. Science, 1977,197:17-25.

　　［4］赵连三，周思亮，王锦蓉，等. 原位杂交技术研究HBV感染与肝 癌的关系. 中国肿瘤临床，1990，17:330-331.

　　［］5赵连三，刘晓松，张智翔，等. 乙型肝炎肝炎病毒感染经精子传 播的可能性研究. 中华传染病杂志，1998，16:154-157.