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四种P-糖蛋白在胃癌组织中表达的研究

www.cnkang.com 2007-1-13 中华康网

　摘要：目的了解术后胃癌的多药耐药性与胃癌组织中P-gp过量表达的关系。方法利用免疫组化方法，以4种抗不同亚型P-gp(C494，MRK16，JSB1和C219)的单克隆抗体(mAb)，以及4种不同抗P-gpmAb的混合抗体和抗p53蛋白mAb，分别检测66例胃癌术后石蜡包埋组织中P-gp和p53的表达(其中16例为冰冻切片)。结果P-gp呈中等或高度表达(占40％～70％)。依次为：C494(75.75％,50/66)，JSB1(62.12％，41/66)，MRK16(48.49％，32/66)和C219(36.36％，24/66)。4种抗P-gpmAb的混合物的阳性检出率为78.79％(52/66)，抗p53蛋白mAb的阳性检出率为60.61％(40/66)。4种抗P-gpmAb的混合物与抗P-gpmAbC494(G=0.90，P∨0.00001)；抗P-gpmAbC494与抗JSB1mAb(G=0.60,P∨0.00005)；抗MRK16mAb与抗C219mAb(G=0.64，P∨0.0001)均高度相关。石蜡和冰冻切片中P-gpC494和JSB1呈中度表达以上者阳性率基本一致；而C219和MRK16的阳性率相差则明显(P∨0.05)。p53蛋白的表达与C494和JSB1的表达相关性显著(P∨0.002和P∨0.002)，与MRK16和C219的表达也有相关性(P∨0.01和P∨0.05)。结论C494阳性表达率最高，可作为胃癌组织中耐药基因检测的标志物。P-gp的过量表达与p53蛋白的表达关系密切。

　　中图号：R735.2　文献标识码：A　文章编号：1007－8738(2000)03－0264－04

Expression of P- glycoprotein in the gastric carcinoma tissues

　　using a panel of four mAbs

FAN Miao　CAO Jin-long　CAI Qing-quan

　　（Department of Pathology, The 455th Hospital of PLA, Shanghai 200052）

　　NI Can-rong

　　（Department of Pathology, The Second Medical University, Shanghai, 2000433, China）

　　Abstract: Aim To understand relationship between multidrug resistance of post operative gastric cancer and P- gp overexpression in the gastric cancer tissues. Methods Paraffin sections from 66 cases of gastric carcinoma(16 cases of them were frozen sections) were immunohistochemically(IHC) analyzed using a panel of 4 different anti P- glycoprotein monoclonal antibodies (mAbs) composed of C494, MRK16, JSB 1 and C219. Cocktail of the 4 mAbs and mAb against p53 protein were also used. Results Moderate to high levels of P- glycoprotein were detected in 40％ to 70％ of gastric cancer. The positive rate of C494 (75.75％ , 50/66)was higher than those of JSB 1(62.12％ ; 41/66)， MRK16(48.49％ , 32/66)and C219(36.36％ , 24/66). The positive rate of cocktail of the 4 anti P- glycoprotein antibodies was 78.79％ (52/66). The positive rate of p53 protein was 60.61％ (40/66). The positive expression of cocktail of the 4 anti P- glycoproteins was closely related to 4 anti P- gly coprotein C494(G=0.90， P∨ 0.00001)； The positive expression of C494 was closely related to JSB 1(G=0.60,P∨ 0.00005). The positive expression of MRK16 was closely related to C219(G=0.64， P∨ 0.0001). There were similar positive expressions of C494 and JSB 1 between corresponding paraffin and frozen sections, but different ones between C219 and MRK16. Expression of p53 protein was closely related to C494(P∨ 0.002), JSB 1 (P∨ 0.002), MRK16 (P∨ 0.01) and C219 mAbs(P∨ 0.05). Conclusion The positive expression of C494 was the highest and could be as a marker for multidrug resistance gene assay. Overexpression of P- glycoprotein was closely related to p53 protein.

　　Keywords: P- glycoprotein; gastric cancer; IHC; CSA; p53 protein ▲

　　胃癌的发病率很高，大多数患者被确诊后已是中晚期，并可远距离转移，复发率高，预后较差；另一方面，因该肿瘤对化疗药物不敏感，疗效仅15％～20％，较其它肿瘤的疗效(40％～70％)低。多柔比星(epidoxorubicin)或鬼臼乙叉甙(etoposide/VP16)是胃癌患者术后常用的化疗药，疗效最高，但最终的治疗效果较差，这可能与天然或继发多药耐药(multidrugresistance,MDR)的产生，P-糖蛋白(P-gp)的过量表达及其它耐药机制的启动有关。

　　许多研究者〔1，2〕已经在该肿瘤中检测到MDR1mRNA的表达，应用斑点杂交检测的阳性率为41％～80％；而用免疫组化法(immunohistochemicalstaining,IHC)检测P-gp的不同亚型(C219,C494,MRK16和JSB1)的阳性率仅为26％～42％。然而，几种抗P-gpmAb的混合使用，可使P-gp的检出阳性率更准确，其多肽更全面，更能反映出肿瘤组织中P-gp的含量。我们应用4种抗P-gpmAb的　　混合物，做催化信号放大系统免疫组化(catalyzedsignalamplificationimmunohistochemicalstaining,CSAIHC)染色，检测了P-gp4个亚型(C494,C219,MRK16和JSB1)在66例胃癌术后石蜡包埋组织切片(其中16例同时采用冰冻切片)中的表达，并与抗P-gp各个亚型的mAb检测的敏感性相比较，观察了P-gp及各个亚型的表达与p53蛋白表达的相关性。

　　1　材料和方法

　　1.1材料66例胃癌组织标本为我院1994年～1998年外科手术切除标本。患者术前均未经过化疗。标本经100mL/L中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片分别做HE和IHC染色。其中16例为液氮速冻保存的胃癌标本，临用前解冻后用40mL/L多聚甲醛固定，250g/L蔗糖浸泡24h，8μm厚恒冷箱冰冻切片后，于80℃保存备用。66例胃癌中，男52例，女14例，年龄34～75岁(平均58.75岁)。其中高分化腺癌10例，中等分化腺癌30例，低分化腺癌22例(有2例为印戒细胞癌)，未分化腺癌4例。有淋巴细胞转移者38例，无淋巴细胞转移者28例；有随访结果者36例，其中术后生存时间≥3年者20例(55.55％)，∨3年者16例(6例术后3月内，因肝内或腹膜内转移而死亡)，占44.44％(包括3例未分化腺癌，9例低分化腺癌和4例中等分化腺癌)。P-gp(JSB1)购自武汉博士德公司，P-gp(MRK16)购自迈新公司。P-gp(C494和C219),抗p53(pAb1801)和CSAKit购自丹麦Dako公司。

　　1.2方法

　　1.2.1CSAIHC染色石蜡切片脱蜡至水，用0.01mol/LpH7.4PBS洗3次×3min。30mL/LH2O2室温处理20min，同前洗涤。微波抗原修复〔3〕(98℃10min)后，自然冷却，PBS洗3次×3min，依次滴加适当稀释的抗P-gp和抗p53mAb(37℃1h，PBS洗3次×3min)，生物素化马抗鼠IgG(1∶300，37℃30min，PBS洗3次×3min)，第1次HRP标记的链霉亲和素(1∶50037℃30min，PBS洗3次×3min)，酪胺标记的生物素(0.007mmol/L37℃15min，PBS洗3次×3min)及第2次HRP标记的链霉亲和素(1∶1000，37℃30min，PBS洗3次×3min)。如有必要可循环上述步骤数次，以达到信号的最佳放大。最后用0.5g/LDAB＋0.3mL/LH2O2显色(8～10min)，流水洗终止反应，以苏木素衬染后，经洗涤、微波兰化，常规树胶封片。实验中的阳性对照均以CASkit盒内配置的阳性标本片为标准；阴性对照用无关血清或PBS代替抗P-gpmAb和抗p35mAb。

　　1.2.2结果判断标准和统计学处理〔4〕根据染色反应的深度及阳性细胞的数量分别记为0～3分。染色深度：以多数细胞的呈色反应为标准，黄色者为1分，棕色者为2分，深棕褐色者为3分，不着色者为0分。阳性细胞数：50％为1分，50％～80％为2分，∧80％为3分，无细胞染色者为0分。并根据上述两项指标的积分数分为4级，即：阴性(－)为0分，弱阳性(＋)为1～2分，中等阳性(＋＋)为3～4分，强阳性(＋＋＋)为5～6分。统计学处理采用2检验和t检验。

　　2　结果

　　2.1P-gp和p53的分布四种P-gp主要分布于肿瘤细胞的细胞浆内，仅4例核内有C219表达。C494除在胞浆内表达外，在细胞核内也有少量表达。但冰冻切片中，未发现核内表达的病例(图1A～D)。p53全部在肿瘤细胞核内表达(图2)。癌周息肉和正常粘膜上皮P-gp表达在细胞浆内。

　　2.2各种P-gp在胃癌组织中的表达在66例胃癌中，用4种抗P-gpmAb的混合物检出的阳性率最高(78.79％,52/66);4种抗P-gpmAb单独应用时的检出率依次是：C494为75.76％(50/66),JSB1为62.12％(41/66),MRK16为48.49％(32/66)和C219为36.36％(24/66)。总体上看，中度阳性(＋＋)和高度阳性(＋＋＋)表达占40％～70％。

　　2.3四种抗P-gpmAb检出的阳性符合率四种抗P-gpmAb的混合物检出P-gp的阳性率与分别应用抗P-gp4个亚型mAb检出C494，JSB1,MRK16和C219的阳性率均高度相关，分别为:

　　G=0.90，P∨0.00001；G=0.60，P∨0.01；G=

　　0.64，P∨0.005。

　　2.4P-gp4个亚型和p53蛋白的表达表2为石蜡和冰冻切片中4个P-gp亚型表达的阳性例数。结果表明，在石蜡和冰冻切片中，P-gpC494和JSB1均呈中等以上强度，分别为：G=1，P∨0.00001和G=0.58，P∨0.01；而C219和MRK16在冰冻切片中的阳性检出率分别为75％和81％；在石蜡切片中的阳性检出率分别为45％和45％，二者相关显著(P∨0.05)。P-gp和p53蛋白的表达见表3和表4。从表4中可以看出，P53的表达与C494和JSB1的表达相关性显著(分别P∨0.001和P∨0.002)；与MRK16和C219的表达也有相关性，分别为P∨0.01和P∨0.05。

　　图1CSAIHC法检测4种P-gp在胃癌组织中的表达

　　表1各种P-gp在胃癌组织中的阳性表达

Region	Pgp*				C494				MRK16				JSB-1				C219
Region	-	+	++	+++	-	+	++	+++	-	+	++	+++	-	+	++	+++	-	+	++	+++
Tumour areas	14	12	31	9	16	11	23	16	24	12	14	6	15	9	21	11	42	10	11	3
Transition areas	46	16	3	1	50	10	6	0	56	8	2	0	51	11	3	1	58	6	2	0
Mucosa round	56	8	2	0	59	6	1	0	62	4	0	0	60	5	1	0	65	1	0	0
tumour tissue

图2p53在胃癌组织中的表达(CSAIHC,×132)

　　表2冰冻和石蜡切片中4种P-gp亚型的表达

Expression intensity	C94		JSB-1		C219		MRK16
Expression intensity	PRF	FZ	PRF	FZ	PRF	FZ	PRF	FZ
-	3	2	5	4	9	4	7	3
+	1	2	2	2	1	2	1	2
++	8	5	4	8	4	6	3	6
+++	4	7	5	2	2	4	3	5

　　表366例胃癌组织中P-gp和p35蛋白的表达

Antibody used	Postitive cases(%)	Negative cases(%)
AntiC494mAb	50(75.76)	16(24.24)
AntiJSB1mAb	41(62.12)	25(37.88)
AntiC219mAb	24(36.36)	42(63.63)
AntiMRK16mAb	32(48.49)	34(51.51)
Antip53mAb	46(69.69)	20(30.30)

　　表466例胃癌组织中P-gp与p35蛋白表达的相关性


AntiC494/p53mAb	42/46(91.3)a	8/20(40)
AntiJSB1/p53mAb	36/46(78.26)a	5/20(25)
AntiMRK16/p53mAb	28/46(60.86)b	4/20(20)
AntiC219/p53mAb	22/46(47.82)b	2/20(10)

　　3　讨论

　　大多数研究结果显示，P-gp蛋白在胃癌组织中的表达阳性率很低，其中C219，MRK16和JSB1的表达率分别为26％，42％和40％〔5，6〕。本研究中，P-gp表达的阳性率高于文献报道，这可能与IHC染色过程中采用微波抗原修复和敏感的CSAIHC法有关。Tomonage等〔8〕表明，胃癌组织中MDR1的表达仅20％，而多药耐药基因相关蛋白(MRP)的表达则很高。体外培养的细胞无MDR1的表达，提示胃癌组织中MDR1是否表达对癌细胞的耐药性无直接的相关性，可能还存在其它的耐药机制。但本文的结果显示，C494的表达阳性率达75.76％，与Lacueva等〔8〕的研究结果较为一致，提示胃癌组织和其它肿瘤组织类似，MDR1起主要作用。

　　P-gp在石蜡切片和冰冻切片中的阳性率基本一致，因此，石蜡切片完全可以作为MDR1的检测标本，尤其是对C494的检测更为理想。MRK16在石蜡切片中的表达较冰冻切片中低。

　　P-gp的表达与突变型p53蛋白的累积之间的相关性存在较大差异。在乳腺癌中，P-gp和p53的表达密切相关，而在妇产科肿瘤和B细胞慢性淋巴细胞白血病中则无相关性。Oka等〔11〕对40例结肠癌的研究发现，p53和P-gp的共同表达关系密切。本研究在66例胃癌组织中，P-gp4个亚型的阳性表达均与p53的表达关系密切。MDR1基因表达受多种因素的影响。重金属、生长因子及活化的癌基因等，均可通过活化磷酯酶C而使MDR1启动子的活性增加。突变型p53功能的丧失可引起基因组不稳定，这种内在特性可能就是MDR1在高度恶性细胞内扩增，最终表现为MDR的原因，人们已在结肠癌、乳腺癌及胃癌中得到证实。■Fig 1 Expressions of 4 P- glycoproteins in gastric cancer tissues by CSA IHC A: Expression of MRK16(× 66); B: Expression of C494(× 330)； C： Expression of JSB 1(× 330); D: Expression of C219(× 132).

　　Fig 2 Expression of p53 protein in gastric cancer tissues (CSA IHC, × 132)

　　Tab 1 Positive cases of 4 P- gp expressions in the 66 cases ofgastric cancer tissues (n=66) Pgp C494 MRK16 JSB 1 C219 Region

　　Tab 2 Positive cases of 4 P- gp expressions in frozen(Fz)tissues and paraffin (PRF) embedded tissues (n=16) Expression C494 JSB 1 C219 MRK16 intensity PRF FZ PRF FZ PRF FZ PRF FZ

　　Tab 3 Positive rates of P- gp and p53 protein expressions in the 66 cases of gastric cancer tissues Antibody used Positive cases(％ ) Negative cases(％ )

　　Tab 4 Correlation between P- gp and p53 protein expressions in the 66 cases of gastric cancer tissues ─ ─ Antibody used ＋ /＋ (％ ) ＋ /－ (％ )

　　a: The p53 expression was highly consistent with C494 and JSB 1 ex presions (P∨ 0.01 and P∨ 0.002, respectively);b: The p53 expression was significantly correlated with the MRK16 and C219 expressions(P∨ 0.01 and P∨ 0.05, respectively).

　　作者简介：范淼，女，37岁，技师上海市淮海西路338号， Tel.(021)62800157

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