ELISA快速法检测血吸虫病人血清抗体的研究

　　为了提高ELISA的检测速度，使之更方便地应用于临床诊断及现场调查工作，根据ELISA的实验原理，我们设计了一种ELISA快速法，并初步应用于血吸虫病人血清抗体的检测，现报告如下。

　　1　材料与方法　①日本血吸虫成虫抗原的制备　以1500条日本血吸虫尾蚴经皮肤感染家兔，45天后经门静脉灌注收集成虫，用生理盐水洗涤后用玻璃匀浆器匀浆，以12000×g离心，收集上清液，测定其蛋白含量。②酶联SPA结合物　购自卫生部上海生物制品研究所，临用前用1ml PBS溶解。③血清　50份日本血吸虫病人血清来自江西省血吸虫病流行区，临用前分别用1∶2，1∶10；1∶20；1∶40的HRP-SPA液将血清稀释到1∶50的浓度。④ELISA快速法的建立　用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释日本血吸虫成虫抗原至80μg/ml，每孔50μl包被酶标板，4℃放置过夜，第二天用PBS洗涤三次后用含1%BSA的PBS液于37℃封闭45min，用PBST(含0.05%Tween-20)洗板三次；在酶标板孔中分别加入用不同稀释度的酶联SPA稀释到1∶50的病人血清50μl，37℃反应60min，再用PBST洗板三次，加入底物邻苯二胺应用液50μl，37℃显色10min，加入2mol/L的硫酸溶液中止反应，观察结果，寻找最适的酶联SPA液的工作浓度。⑤检测血吸虫病人血清抗体　方法同④，酶联SPA的工作浓度为1∶40，病人血清的稀释度为1∶50。⑥常规ELISA检测血吸虫病人血清抗体　按常规方法［1］，以每孔50μl日本血吸虫成虫抗原包被酶标板，4℃放置过夜，第二天用PBST洗板三次后用含1%BSA的PBS 37℃封闭1小时，用PBST洗板后加入1∶50稀释的病人血清，37℃反应60min，用PBST洗板三次，再加入1∶40稀释的酶联SPA，37℃反应60min，洗板后加入底物邻苯二胺应用液，37℃显色10min，用2mol/L的硫酸终止反应，观察结果。

　　2　结果与讨论　常规的ELISA检测血清抗体的方法是将已知的抗原包被在酶标板上，与血清中待测抗体结合后通过加入酶联抗人IgG(HRP-IgG)或酶联SPA(HRP-SPA)显色的两个过程来完成的。HRP-SPA与血清中待测抗体结合的位点是Ig的Fc段，从理论上讲HRP-SPA与Ig的Fc段结合不会影响Ig的Fab段与抗原的结合，或者影响很小，因此可以设想将抗原与待测抗体反应的过程，待测抗体与酶标二抗反应过程在同一反应体系中同时进行，从而使整个反应过程减少一步，Sundaram等［2］根据这一原理设计了偶联探针Western blot方法，取得了好的实验效果，我们依据相同的原理，设计了ELISA快速法，用于检测血吸虫病人血清抗体。用该法及常规ELISA同时检测50份江西省血吸虫病流行区病人血清标本，49份结果阳性，1份标本为阴性，阴性标本均为第7份标本，两种方法的检 测结果完全一致。

　　抗原与待测抗体反应的过程，待测抗体与酶标二抗反应过程在同一反应体系中同时进行，因病人血清中存在的非目标检测抗体会消耗一部分HRP-SPA，为达到常规ELISA检测的敏感度，则可能需要增加HRP-SPA的用量，通过测定HRP-SPA的工作浓度与可检测出血清抗体滴度的关系，发现分别按1∶2，1∶10，1∶20，1∶40稀释的HRP-SPA，能测出混合阳性血清最高滴度均为1∶12800，与常规的ELISA的检出滴度相同，因此ELISA快速法并不需要增加HRP-SPA的用量，常规使用时只要按厂家推荐的1∶40的工作浓度使用即可获得满意的使用效果。

　　ELISA快速法的抗体检测效果与常规ELISA相同，检测条件亦一致，检测时间则可明显缩短，可显著提高工作效率，对提高抗血吸虫抗体以及其它血清抗体检测方法的检测速度方面将会有一定的实用价值。

　　3　参考文献

　　1　武建国主编.实用临床免疫学检验.1990：102-108.

　　2　Pazhani Sundaram. A simplified coupled probing approach for the detection of proteins on dot and Western blots.Immunol Method 1996；195∶149-152.