幽门螺杆菌CagA蛋白的纯化与鉴定

　　【 摘要 】　目的　纯化幽门螺杆菌（Hp）相对分子质量（Mr）为130×103(CagA)蛋白，为单抗及疫苗的研制打下一定基础。方法　 用盐酸胍粗提、分子筛层析及凝胶洗脱法纯化Hp97002株Mr为130×103（CagA）蛋白并鉴定。用Western blot方法分析68例患者血清中Mr为130×103（CagA）蛋白的阳性率。结果　纯化蛋白Mr为130×103，电泳纯，并保持良好的抗原性。有43例患者血清能与纯化的Mr为130×103（CagA）蛋白反应，其阳性率随着浅表性胃炎、萎缩性胃炎、消化性溃疡和胃癌的排列次序呈逐渐增高趋势。结论　Mr为130×103（CagA）蛋白与胃部疾病的严重性相关。

Purification and identification of CagA protein of Helicobacter pylori

YE Shaojing, FANG Pingchu, LI Chao

　　(long. College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310031, P.R.China)

　　【 Abstract 】　Objective　To purify and identify the CagA (cytotoxin-associated gene A) protein of clinical isolate Hp97002 and to investigate the relationships between the purified CagA (molecular weight of 130000) protein and gastric diseases.Methods　Using 6M guanidine extract, size exclusion chromatography and elusion from gel was the purified protein (CagA). Sera of 68 patients with gastric diseases (44 with chronic gastritis, 15 with atrophic gastritis, 7 with peptic ulcer disease, 2 with gastric cancer) were obtained, and the serological response to CagA was studied by Western blot using the purified protein.Results　The purified protein was molecular weight of 130000 with good antigenicity and revealed basic isoelectric point about 8.1. Among 68 sera, 43 sera could recognize the purified proteins from the patients of chronic gastritis 47.7% (21/44), atrophic gastritis 86.7% (13/15), peptic ulcer disease 100% (7/7), gastric cancer 100% (2/2), the difference was significant (χ2=13.327, P=0.004).Conclusion　CagA (molecular weight of 130000) protein was associated with severe gastric diseases.

　　【 Subject words 】　Helicobacter pylori; CagA; Elution from gel; Western blot

　　幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）感染已被公认为人类慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡的重要病因，并且与胃癌和胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生密切相关。全球范围内大约有50%～80%的成人有Hp感染〔1〕。但Hp感染人群大多无症状，只有少数感染者可出现胃溃疡、十二指肠溃疡，极少数感染者最终发展为胃癌。出现上述不同感染结果的主要原因是Hp菌株的多样性〔2，3〕。国外目前的研究表明，Hp菌株cagA (cytotoxin-associated gene A)及其表达产物CagA蛋白与胃部疾病的严重性相关〔4-6〕，但CagA蛋白的功能迄今尚不清楚。本实验采用膜蛋白的分离纯化原理和技术，对Hp临床分离株Hp 97002的相对分子质量(Mr)为130×103（CagA）蛋白进行分离纯化，并对其与胃部疾病的关系作初步探讨，为进一步研究CagA在胃部疾病发生发展过程中的作用打下基础。

　　材料与方法

　　菌株和生长条件：Hp97001、Hp97002、Hp97003、Hp97004和Hp97005菌株，从临床胃粘膜活检标本分离，并经系统鉴定。NCTC11637为CagA阳性Hp国际标准株。上述Hp菌株分别接种于ECY固体培养基〔7〕，微需氧（5% O2，10% CO2，85% N2）37℃培养48 h，用PBS洗下菌苔，5 000r/min，20 min离心洗涤2次，存放于-20℃备用。

　　血清：Hp阳性人血清为5份Hp培养阳性的胃溃疡患者的混合血清。Hp阴性人血清为经血清学、组织学、Hp培养、14C呼气试验证实无Hp感染的1份健康人血清。兔抗Hp血清来自NCTC11637免疫家兔获得的血清。

　　胍提取抗原的制备：将冻存的Hp用PBS稀释至适当浓度，经6mol/L盐酸胍处理，其上清即为胍提取抗原。

　　SDS-PAGE：参照Leammli〔8〕不连续电泳方法。

　　Western blot：样品经SDS-PAGE后，电转移至硝酸纤维素膜(10V，20 h)。滤膜封闭后与一抗作用2 h，洗膜后移入二抗溶液(HRP-SPA)中孵育2 h；再洗膜4次后用二氨基联苯胺(DAB)显色。

　　分子筛层析：选用Sephadex G-200(粒度40～120μm，Pharmacia公司)，柱型为1.6×100cm，在层析成套设备（LKB公司）中进行。

　　凝胶洗脱法：参照Bernabeu〔9〕方法。

　　凝胶等电聚焦电泳：采用2% Ampholine（pH 3～10），阴极电极液为0.02 mol/L NaOH，阳极电极液为0.01 mol/L H3PO4，恒压180V，电泳聚焦6 h。

　　纯化蛋白与胃部疾病的关系：68例因胃部疾患就诊于浙医一院的门诊患者。以内窥镜检查，于胃窦和胃体部取活检标本各一块。活检组织进行Hp培养和组织学检查，并作快速尿素酶试验和直接涂片镜检Hp。每人同时采血2ml，分离血清。经组织学证实浅表性胃炎44例，萎缩性胃炎15例，消化性溃疡7例，胃癌2例。采用Western blot方法分析纯化的Mr 为130×103 (CagA)蛋白与胃部疾病的关系，结果采用SPSS 8.0 for Windows 98统计软件包，进行Chi-square(χ2)和Spearman′s相关分析。

　　结果

　　1．Hp97002 Mr为130×103（CagA）蛋白的纯化：Hp97002盐酸胍粗提上清液，经Sephadex-G200分子筛层析，共出现A、B、C和D 4个相互分离的280nm吸收峰（图1），获得相应的4个组分。SDS-PAGE结果显示，Mr为（128～140）×103的蛋白质在A组分内。