移植NT-4基因修饰细胞对大鼠前角运动神经元损伤的保护作用

　

　

　　摘　要　目的：观察神经营养素4(NT-4)基因修饰细胞对成年大鼠脊髓前角运动神经元损伤的保护作用。方法：应用逆转录病毒介导的体外NT-4基因转移方法，制备高表达NT-4的基因修饰细胞。离断大鼠左侧坐骨神经作为外周神经损伤模型，右侧作为对照，在离断处移植NT-4基因修饰细胞。观察大鼠脊髓前角运动神经元尼氏染色和胆碱酯酶染色的变化。结果：在移植NT-4基因修饰细胞组和对照组间，尼氏和胆碱酯酶染色有显著性差异。结论：移植NT-4基因修饰细胞对外周神经损伤所造成的运动神经元的退变有显著的改善作用。

　　关键词：神经营养素4　神经损伤

　　神经营养素4(NT-4)是神经营养素家族成员之一，NT-4的成熟蛋白有123个氨基酸，受体为TrkB［2］。它在中枢和外周分布很广，对运动神经元、基底前脑的胆碱能神经元，以及海马、下丘脑、延髓等处的神经元的生长、分化具有促进作用［3,4］。最近的研究发现，NT-4不仅对神经元有促进存活、生长和分化作用，而且对神经肌肉接头的形成有促进作用，能够诱导正常运动神经元出芽［5］。因而NT-4对运动神经元的疾病有潜在的治疗作用，如对脊髓损伤的修复，对肌萎缩侧束硬化症的治疗等。然而对于神经损伤和某些退行性疾病的治疗需要长期用药，这是比较困难的，而用移植基因修饰细胞的方法则可经一次或几次治疗而得到长期有效的结果。

　　1　材料和方法

　　1.1　NT-4基因修饰细胞　采用重组逆转录病毒介导的体外NT-4基因转移方法，制备高表达的NT-4的肌母细胞(L-6TG)［6］作为NT-4基因修饰细胞，表达的NT-4蛋白经检测具有神经营养活性，表达量为每106 细胞每24h500U。

　　1.2　动物与动物模型　体质量为180～200g的SD大鼠21只，随机分为3组：(1)损伤组，(2)移植普通L-6TG细胞的对照组，(3)移植NT-4基因修饰细胞组，每组再分为1周和2周两个时间点。除了损伤组第1周为6只大鼠外，其余均为3只大鼠。把大鼠左侧坐骨神经从刚出孔处切掉0.5cm，作为外周神经损伤模型。同时在坐骨神经离断处移植相应细胞，损伤组不移植细胞。

　　1.3　观察指标［7］　3组动物术后正常饲养，对术后1,2周各组动物以2%戊巴比妥钠麻醉后，取脊髓L4～6(每1只动物取5片)冷冻切片进行尼氏(Nissl)染色，观察神经元的形态变化情况。神经元的计数是在Leica quantitation 570图像分析系统上进行，根据染色的灰度、大小制定统一标准，然后由计算机自动计数。胆碱酯酶(ChE）是神经细胞胞体中活性变化较明显的酶，我们采用亚铁氰化铜法进行ChE染色，然后在上述图像分析系统上对染色后的切片进行图像处理。对同一批染色的切片，根据染色灰度的情况定下统一标准，然后由计算机自动计数，统计阳性颗粒的面积。各组的正常侧和离断侧(左右两侧)ChE染色阳性颗粒面积的百分率，按(左侧阳性面积/右侧阳性面积)×100%计算。

　　2　结　果

　　2.1　尼氏染色的结果　术后2周，损伤组脊髓切片尼氏染色在低倍镜下见脊髓正常侧前角外侧核大、中型神经元呈深色，细胞轮廓清楚(图1A)；高倍镜下损伤组正常侧如图2A所示；坐骨神经切断侧相应的深染神经元减少，有一部分神经元染色变淡，一些神经元轮廓不清楚，高倍镜下损伤组损伤侧如图2B所示。NT-4基因修饰细胞移植组损伤侧神经元染色与正常侧相比差别不大(图1B,2C,2D)。
　　Fig 2　Nissl staining in injury and NT-4 groups(3.3×20)

　　A: Nissl staining in normol side of injury group; B: Nissl staining in injury side of injury group; C:Nissl staining in injury side of NT- 4 group; D: Nissl staining in normol side of NT-4 group

　　坐骨神经切断1,2周后，NT-4基因修饰细胞移植组、L-6TG细胞移植组和损伤组脊髓前角外侧核大、中型神经元的数量见表1，对各组左右侧进行了配对t检验。

表1　坐骨神经切断1,2周后各组神经元的数量

　　Tab 1　The results of Nissl stained neurons after sciatic nerve apocope at one and two weeks

(±s)
 
Group 1 week 2 week
Left Right Left Right
NT-4
14.1±2.5
 
15.7±1.9
 
12.8±2.6
 
15.4±3.8
 
L-6TG 13.6±1.4 16.0±2.5 13.7±1.4* 19.8±2.2
Injury 19.7±6.6 23.0±5.7 14.2±0.6* 20.6±1.9

*P＜0.05 vs right

　　坐骨神经切断术后1，2周NT-4组尼氏染色阳性神经元的百分率分别为86.3%，84.8%，而损伤组的百分率分别为82.5%，64.2%，两组之间第2周组有显著性差异(P＜0.05)。L-6TG组和损伤组之间均无显著性差异。

　　2.2　胆碱酯酶染色结果　坐骨神经切断后1和2周，NT-4基因修饰细胞移植组、L-6TG细胞移植组和损伤组的正常侧和离断侧(左右两侧)脊髓前角外侧核ChE染色阳性颗粒面积的百分率见表2，对各组间数据进行了非配对资料的t检验。

表2　坐骨神经离断后各组ChE染色阳性面积的百分率

　　Tab 2　Percentage of the ChE stained areas after sciatic nerve apocope at one and two weeks

(±s，%)
 
Group 1 Week 2 Week
NT-4
62.6±5.2**
 
79.0±6.0*
 
L-6TG 56.8±5.8 64.6±6.2
Injury 33.5±8.8 60.9±5.6

*P＜0.05,**P＜0.01 vs injury group

　　3　讨　论

　　外周神经损伤后，部分神经元死亡而消失，部分存活神经元呈现程度不同的逆行性变化，如胞核偏位、粗面内质网解聚、溶酶体增多及一些酶的活性发生变化，其中以ChE活性变化明显。ChE位于粗面内质网中，它与粗面内质网的结构完整和功能活动密切相关。神经元损伤后，ChE活性减弱，提示粗面内质网的数量减少和功能消退。Friedman等［8］的实验发现切断成年大鼠坐骨神经后1周，给予NT-4 12μg/d，能够使乙酰胆碱转移酶免疫组化染色显著增加，达到正常侧的79％，而给予生理盐水的只有正常侧的38％。切断新生大鼠面神经，6d共给予NT-4 20μg，可使面神经核的神经元(尼氏染色)达到正常侧的73％，而给予生理盐水的只有27％［9，10］。本实验切断大鼠坐骨神经后，观察了2周内ChE组化染色阳性面积的变化情况，移植NT-4基因修饰细胞的动物，1周可达正常侧的62.6%，2周可达79.0％；而损伤组1，2周分别为33.0%，60.9%，说明第1周NT-4治疗作用最明显，提示神经损伤后应用神经营养因子时间越早，效果越好。

　　分析损伤组各时间点的情况，坐骨神经切断1周时ChE染色达到最低点，以后有所增加。统计结果表明，1周和2周的ChE染色的百分比(左/右)之间有显著性差异(P＜0.05)，ChE染色逐渐增加，说明ChE活性有所恢复。这可能是坐骨神经切断时间延长后，动物机体产生代偿作用。

　　当神经元受到损害时，如出现轴突断裂，尼氏小体逐渐分解以至消散，这种现象称为染色质溶解，此时神经元的尼氏染色将变淡或消失。本实验发现坐骨神经切断后的第1，2周，损伤侧尼氏染色阳性神经元分别为正常侧的82.5%和64.2%。这一结果表明，损伤组尼氏染色阳性神经元的数目在第1周减少得不明显，第2周显著减少。NT-4基因修饰细胞移植组，在1,2周损伤侧尼氏染色阳性细胞均为正常侧的80%以上，相互之间没有显著性差异。

　　坐骨神经离断后，在损伤处移植NT-4基因修饰细胞，我们观察到它对脊髓前角外侧核大、中型神经元有明显的保护作用，这对于NT-4治疗作用的研究以及基因治疗方法用于临床是很有意义的。

　　作者单位：侍坚　路长林　曲伸　何小龙　王成海　第二军医大学基础医学部神经生物学教

　　研室,上海,200433

　　侍坚,女1958年8月生,博士,讲师

　　参 考 文 献

　　[1]　Lewin GR，Barde YA. Physiology of the neurotrophins. Annu Rev Neurosci， 1996,19(2):289

　　[2]　Hallbook F, Ibanez CF, Persson H. Evolutionary studies of the nerve growth factor family reveal a novel member abundantly expressed in xenopus ovary. Neuron， 1991, 6(5):845

　　[3]　Schober A, Wolf N, Huber K，et al. TrkB and neurotrophin-4 are important for development and maintenance of sympathetic preganglionic neurons innervating the adrenal medulla. J Neurosci， 1998,18(18):7272

　　[4]　Becker E, Soler RM, Yuste VJ, et al. Development of survival responsiveness to brain-derived neurotrophic factor, neurotrophin 3 and neurotrophin 4/5, but not to nerve growth factor, in cultured motoneurons from chick embryo spinal cord. J Neurosci， 1998,18(19): 7903

　　[5]　Funakoshi H, Belluardo N, Arenas E，et al. Muscle derived neurotrophin-4 as an activity-dependent trophic signal for adult motor neurons. Science， 1995, 268(5216): 1495

　　[6]　侍　坚,何小龙,王成海,等. 神经营养素-4基因工程细胞的构建.中国神经科学杂志， 1998，14(3):134

　　[7]　杜卓民 主编.实用组织学技术.第2版. 北京：人民卫生出版社，1998.144～329

　　[8]　Friedman B, Kleinfeld D, Ip NY，et al. BDNF and NT-4/5 exert neurotrophic influences on injured adult spinal motor neurons. J Neurosci， 1995,15(2):1044

　　[9]　Yan Q, Elliott JL， Matheson C，et al. Influences of neurotrophins on mammalian motoneurons in vivo. J Neurobiol， 1993,24(12):1555

　　[10]　Koliatsos VE, Cayouette MH, Berkemeier LR，et al. Neurotrophin 4/5 is a trophic factor for mammalian facial motor neurons. Proc Natl Acad Sci USA，1994, 91(6):3304