基因重组人血红蛋白的纯化

　　摘　要　目的：探索重组人血红蛋白的纯化方法。方法：将α、β珠蛋白串联基因克隆进pBV220表达载体，获得了高效表达，表达产物达细菌总蛋白的20%左右。该表达产物以包涵体形式存在，包涵体经洗涤后，用8 mol/L尿素溶解，先用Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换纯化后，又经Sephacryl-100凝胶过滤纯化。结果：经两步纯化后重组人血红蛋白的纯度达90%左右。纯化产物经复性，具有与氧结合的能力。结论：成功地得到人重组血红蛋白的纯化方法。

　　中图分类号　Q503

Purification of Recombinant Human Hemoglobin

Zhang Hao, Mao Bingzhi, Li Xiaoxia, Wang Quanli, Feng Qi, Liu Xiaoda

　　（Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medical Sciences (Beijing 100850)

　　Abstract　Purpose:The aim is to study the purification methods of recombinant human hemoglobyin.Methods:Conjugated α-and β-globin chain genes were introduced into expression vector pBV220. The expression product reached about 20% of total bacterial protein. They were expressed as inclusion bodies.After washing with 4 mol/L urea, inclusion bodies were dissolved in 8 mol/L urea.Purification was first performed on a column of Q-sepharose Fast Flow,and further purification was performed on a column of Sephacry-100，which resulted in the elimination of most of the contaminated proteins.Results:The purity of recombinant human hemoglobin is about 90% after two steps of purification. The purification product had biological activity after refolding and renatured reaction.Conclusions:The methods to purify recombinant human hemoglibin were established.

　　Key words　Hemoglobin, Escherichia coli, Experssion, Protein purification

　　目前血源短缺以及输血引起病毒感染和传播的情况屡有发生，因此，寻找安全、可靠、充足的血液来源成为紧迫任务。基因工程的理论和技术为这一问题的解决提供了依据。国外已成功地在大肠杆菌中

　　表达了人重组血红蛋白(rHb)，但其表达量仅占总蛋白的5%～10%，且多以化学方式诱导表达，使重组血红蛋白的生产成本高。我们在以前重组血红蛋白上游研究工作的基础上［1］，对rHb的下游纯化工作进行了初步尝试，希望找到简便易行的纯化方法。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　仪器　AKTA purifier,Amersham Pharmacia Biotech;AVL OMNITM-3型血气仪，瑞士AVL；超声破碎仪，宁波新芝电器研究所；CS930双波长薄层扫描仪，日本岛津公司。

　　1.1.2　质粒和工程菌　pBV220/α、β质粒含人血红蛋白α、β珠蛋白的串联基因，该质粒本室构建并保存，并经测序证实。α、β串联基因受PRPL启动子控制，其前后分别具有SD序列、起始密码子、终止密码子，α、β基因连接处由70 bp左右核苷酸间隔。表达α、β珠蛋白的JM109菌，本室保存。

　　1.2　方法

　　1.2.1　工程菌的热诱导表达　少量阳性重组子接种于含氨苄青霉素50 mg/L的LB培养液中，培养过夜，次日按1%～2%接种培养，加入血红素40 mg/L，葡萄糖20 g/L，30℃培养A600达0.4～0.6时，42℃继续诱导培养4～5 h。

　　1.2.2　SDS电泳及纯度鉴定　用SDS-PAGE凝胶分离蛋白质，上层胶浓度为5%，下层胶浓度为15%，120 V电泳5 h，凝胶用考马斯亮蓝染色。用双波长薄层扫描仪进行扫描测定纯度。

　　1.2.3　包涵体的制备、洗涤和溶解　发酵培养物1 L于4℃、4 000 r/min离心30 min后，细菌沉淀悬浮于一定体积的Tris-HCl-EDTA(TE)缓冲液中，加入溶菌酶，超声破碎(6×30 s,400 W)，离心。沉淀用9倍体积的1%Triton X-100洗涤，再分别用0.5、1、2和4 mol/L(含0.01 mol/L Tris-HCl,pH 8.7,2 mmol/L EDTA)尿素洗涤，分别保留上清和沉淀，以便检测目的蛋白在低浓度尿素中的溶解和洗涤程度。洗涤好的包涵体溶于8 mol/L尿素(含0.05 mol/L Tris-HCl,pH 8.7,2 mmol/L EDTA,50 mmol/L二硫苏糖醇(DTT),0.1 mol/L NaCl)中，室温放置4～8 h，并不断搅拌，然后离心，用SDS-PAGE检测上清和沉淀中目的蛋白的分布。

　　1.2.4　Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析　柱体积为2.6 cm×30 cm，上样前柱子至少用2倍柱体积的平衡液(A液)平衡。A液为含8 mol/L尿素、25 mmol/L Tris-醋酸(pH 9.0)、1 mmo/L EDTA和1 mmol/L DTT的溶液。经以2 ml/min的流速上样，起始洗脱缓冲液为A液，其后用含A液和B液进行梯度洗脱。B液为含0.5 mol/L NaCl、8 mol/L尿素、25 mmol/L、Tris-醋酸(pH 9.0)、1 mmol/L EDTA和1 mmol/L DTT的溶液。280 nm紫外监测，依次洗脱至不再出峰，分步收集洗脱液，进行SDS-PAGE。

　　1.2.5　Sephacryl-100凝胶层析　柱体积为2.6 cm×100 cm，上样(经Q-Sephacryl Fast Flow阴离子交换样品)前柱子至少用2倍柱体积的平衡液平衡，平衡液为8 mol/L尿素(含50 mmol/L Tris-HCl、pH 7.0，1 mmol/L EDTA，0.1 mol/L NaCl和1 mol/L DTT)，上样体积约为柱体积的2%，流速控制为15 ml/h。280 nm紫外监测洗脱液，用自动收集器分管收集洗脱液，再用SDS-PAGE鉴定各管组分。

　　1.2.6　血红蛋白的复性［3～7］　经Sephacryl-100凝胶过滤纯化的样品，超滤除菌(以下试剂均经超滤除菌)；用8 mol/L尿素(含0.05 mol/L Tris-HCl、pH 7.0，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L GSH和1 mmol/L GSSG)分别稀释蛋白浓度为0.2 mg/ml，依次缓慢对7、6、5、4、3、2 mol/L尿素(含0.05 mol/L Tris-Cl、pH 7.0，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L GSH和1 mmol/L GSSG)透析48 h。将两个亚基等摩尔混合(蛋白浓度为0.1 mg/ml)，加入血红素(摩尔数与蛋白相同)、二连亚硫酸钠(摩尔数与蛋白相同)、Catalase(1 μg/ml)，溶液用CO饱和，分别复性1、3、4 d。用CO饱和的50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)在10 mmol/L NaCl溶液透析，逐渐去除尿素。浓缩蛋白浓度为20 mg/ml(约0.5 ml)，通入氧气、光照、冰浴条件下，逐步将HbCO转换为HbO2。

　　1.2.7　重组血红蛋白的生物活性测定　在pH 7.0下，用AVL OMNITM -3型血气仪测定50%血氧饱和度时的分压血氧值(P50)。

　　2　结　果

　　2.1　α、β珠蛋白的等电点分析

　　为摸索离子交换分离的条件，首先用Goldkey软件对α、β珠蛋白的等电点进行了分析，α珠蛋白pI=8.93，β珠蛋白pI=7.14。

　　2.2　离子交换进行纯化

　　样品于经过平衡处理的强阴离子柱Q-Sepharose F.F，流速2.0 ml/min，平衡液洗去不保留组分。然后以A液和B液梯度洗脱，流速2 ml/min，分步收集洗脱液并进行SDS-PAGE分析。结果表明，蛋白主要位于吸收峰中，如图1所示。

　　在上述初步分离的基础上，减慢离子梯度对产物进行精细的分离纯化，结果α在电导8.0的峰中，β在电导28.4的峰中。经过强阴离子柱纯化，α、β单个组分的纯度分别达70%以上(见图2)。

　　2.3　凝胶过滤纯化

　　分别以Q柱洗脱的组分上样，分步收集洗脱峰(见图3a、3b)，进行SDS-PAGE分析。电泳结果显示，经阴离子交换层析和凝胶排阻层析，珠蛋白纯度已达90%以上(见图4)。

　　2.4　重组血红蛋白的复性和生物活性的测定

　　我们在血红蛋白复性的实验中，发现复性时间的长短对血红蛋白的正确复性影响很大。复性1、3 d 的样品中未发现与氧结合的活性，至少需要复性4 d以上的样品中才发现与氧结合的活性。pH 7.0条件下测得样品的P50为19.9 mmHg，与文献报道［8］一致。初步表明基因重组的血红蛋白具有与氧结合的能力。

　　3　讨　论

　　重组血红蛋白以包涵体形式存在。包涵体溶解后进行纯化，实验室规模常采用的纯化方法主要有凝胶过滤法、离子交换层析法、疏水层析法、亲和层析法、反相层析法。一般来说，层析步骤越多，总回收率越低。我们根据血红蛋白α、β珠蛋白等电点不同的特点，首先利用离子交换层析的方法，选择Q-Sepharose F.F作为第一步纯化用填料，将α、β珠蛋白分开。然后根据α、β珠蛋白分子量与层析介质孔径大小的对应关系，利用凝胶过滤法，选用Sephacryl-100作为第二步纯化用填料，进行进一步的纯化。最终血红蛋白α、β珠蛋白的纯度可达到90%以上。因基因重组血红蛋白具有潜在的市场需求，故受到了国外各大生物公司的高度重视。近年来陆续在新的宿主(如酵母细胞、昆虫细胞、转基因动物、转基因植物)中进行rHb的表达［9～12］。由于传统采供血系统不能解决病毒污染等问题，利用基因工程是大势所趋。最近绿十字公司利用基因工程生产的人基因重组白蛋白，达10 g/L，这对于血红蛋白的研究无疑是令人鼓舞的消息。

参考文献

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