您的位置：中华康网 >> 生物化学文献 >> 人La多肽融合蛋白在E.coli中的表达

人La多肽融合蛋白在E.coli中的表达

www.cnkang.com 2007-3-20 中华康网

　　摘要: 目的　构建在E.coli中表达人La多肽的质粒。方法　以人脾cDNA为模板,通过PCR获得La多肽(全长)的DNA片段。将此片段利用双酶切定向克隆到MBP(麦芽糖结合蛋白)融合系统的载体pMALTM-c中，表达可溶性融合蛋白，并通过亲和层析予以纯化。结果　免疫印迹实验(IBT)证明, 表达的融合蛋白具有La抗原多肽的特异性,而敏感性超过生化制备的ENA制品。结论　重组融合蛋白与天然ENA制品存在免疫学同一性。

　　中图号 : Q55　文献标识码：A　文章编号： 1007－8738(2000)03－0207－04

Cloning and expression of a fusion protein with human La polypeptide in E.coli

ZHAO Xiao-yu　LIU Jian-rong　JING Tian-yu　WANG Hui-wen　WANG Yan-fang　WANG Xi-ming

　　（Institute of Biotechnology, Hebei University, Baoding 071002, Hebei Province, China ）

　　Abstract: Aim To construct a vector expressing human La polypeptide in E.coli. Methods The full length DNA fragment encoding La polypeptide was obtained by PCR from human spleen cDNA. The La DNA fragment was cloned into plasmid pMAL c(a maltose binding protein, MBP fusion vector) and expressed in E.coli. The soluble MBP La fusion proteins were purified by affinity chromatography using amylose resin. Results Western blot showed that the fusion protein could react with anti La antibody as the natural La polypeptide, and the sensitivity was higher than natural antigen. Conclusion The fusion La polypeptide has the immunoidentity with natural La polypeptide. length DNA fragment encoding La polypeptide was obtained by PCR from human spleen cDNA. The La DNA fragment was cloned into plasmid pMAL c(a maltose binding protein, MBP fusion vector) and expressed in E.coli. The soluble MBP La fusion proteins were purified by affinity chromatography using amylose resin. Results Western blot showed that the fusion protein could react with anti La antibody as the natural La polypeptide, and the sensitivity was higher than natural antigen. Conclusion The fusion La polypeptide has the immunoidentity with natural La polypeptide.

　　Kaywords:La antigen;PCR; cloning; expression; fusion protein ▲

　　La(又名SSB)抗原是存在于哺乳动物细胞核中的一种小核RNA/蛋白质复合物(smallnuclearribonucleoproteincomlexes,snRNP)，即LaRNP。它是由相对分子质量(Mr)为47000的多肽(磷蛋白)与小核RNA组成〔1〕。这些小核RNA包括7SRNA，5SRNA和tRNA前体，以及某些病毒RNA(如:VARNA和EBERRNA〔2，3〕)。La抗原作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止因子,在基因调控中起重要作用〔4〕。临床上干燥综合症(Sjogren'ssyndrome)和系统性红斑狼疮(SLE)等患者体内往往存在抗La抗体，通常利用含有La抗原的可提取性核抗原(ENA)制品检测患者体内的抗La抗体,可为临床鉴别与诊断上述疾病提供依据〔5〕。

　　实验证明，La抗原的抗原决定簇在La多肽上〔7，8〕。我们根据文献报道的编码La多肽的DNA序列〔1〕设计引物,通过PCR扩增获得编码La多肽的特异性DNA片段。将该片段克隆到pMALTM-c表达载体中，在大肠杆菌中以麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的的形式得到表达，并通过亲和层析获得纯化。

　　1　材料和方法

　　1.1材料载体pMALTMc，amyloseresin和兔抗MBP抗血清，为NewEnglandBiolabs公司产品。IPTG，Xgal和T4连接酶，为Promega公司产品。人脾QuickCloneTMcDNA为Clontech公司产品。DH5α和BL21来自中科院生物物理所。PVDF膜为Gelman公司产品。抗La抗体阳性血清来自天津长征医院免疫室。引物由上海生工生物有限公司合成。HRP－羊抗人IgG和HRP－羊抗兔IgG，购于北京生物制品研究所。人脾和猪脾ENA为河北大学生物工程公司产品。

　　1.2方法

　　1.2.1La质粒的构建我们所用载体pMALTMc(简称pc)为麦芽糖结合蛋白(MBP)融合系统。依据人La多肽编码序列〔1〕设计一对引物,以人脾cDNA为模板进行扩增获得DNA片段。选择pc的多克隆位点(polylinker)中EcoRI和SalI两个酶切位点作为外源DNA的插入点，通过T4DNA连接酶将该片段与pc定向连接,并转化到DH5α受体菌中,在含有IPTG和Xgal的培养基上筛选白色重组子。

　　1.2.2免疫印迹实验(IBT)样品经100g/LSDSPAGE电泳后,用Minitransblotelectrophoretictransfercell(BIORAD)电转移到PVDF膜上,以50g/L脱脂奶粉封闭。然后相继与抗血清(一抗)、HRP－羊抗人IgG或HRP－羊抗兔IgG(二抗)反应,DBT显色。

　　1.2.3DNA序列测定以pMALTMc系统malE的正、反向引物,对阳性克隆质粒的插入片段进行DNA序列分析(北京赛百盛公司产品)。

　　1.2.4La多肽融合蛋白的纯化菌体经超声破碎、抽提后，取上清液通过amyloseresin柱，用10mmol/L麦芽糖洗脱。收集洗脱物置低温保存。

　　1.2.5亲和层析纯化抗体将人脾ENA包被在PVDF膜上，与抗La抗体阳性血清反应后，用甘氨酸洗脱，经1mol/LTris盐中和后，低温保存。

　　2　结果

　　2.1La多肽编码DNA片段的扩增根据文献〔1〕报道,本实验设计的PCR引物为：SN:5′GCCGTAATGGCTGAAAATGG3′;ASN:5′CGAAGTGGACCTAATTCGG3′,其中5′端分别加上EcoRI和SalI酶切位点。按此设计要求扩增片段的长度应该为1342bp。以人脾cDNA为模板,利用上述引物进行扩增,扩增条件为:首先94℃变性1min;然后94℃0s，48℃2s，72℃30s，30个循环后,72℃再延伸1min。扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳后,显示出1条长度约为1.4kb的DNA片段

相关阅读
激光在口腔内科的应用及进展国家胆固醇教育计划进展与展望室内氡与肺癌关系流行病学研究进展全国慢性放射损伤学术研讨会总结近5年来国外急性高原低氧研究进展

搞笑
女性
生活
热点
精彩推荐