幼儿园儿童巨细胞病毒分离毒株的限制性酶切图谱分析

　　人巨细胞病毒(HCMV)感染在儿童时期尤为常见。由于绝大多数HCMV感染无明显临床表现，其病毒的排出常为间歇性和多位点性，用传统的流行病学方法难以调查人群中HCMV的传播情况。为探讨幼儿园儿童中该病的流行情况及传播机制，我们对青岛市2所幼儿园的儿童及其保育员和父母的尿标本进行病毒分离，并对分离出的部分HCMV毒株进行限制性酶切图谱分析，现将结果报告如下：

　　材料与方法

　　病毒分离：采集青岛市2所幼儿园部分儿童的尿标本，经抗生素处理接种人胚肺成纤维细胞分离和培养病毒。

　　分离毒株的鉴定：用免疫过氧化物酶法(IPA)对出现CPE的单层细胞进行鉴定，所用单克隆抗体E13系检测HCMV早期非结构核抗原，相对分子质量(Mr)为68×103，第二抗体为HRP标记的羊抗鼠IgG。

　　病毒DNA的提取：细胞病变接近100%时，收集细胞培养液后，5?000r/min 4℃离心10?min，然后分别收集培养上清液和细胞沉淀。病毒DNA的提取参照Lena法〔1〕。

　　病毒DNA的纯化：上述提取的HCMV DNA样品在含溴化乙锭的0.8%低熔点琼脂糖凝胶内电泳，长波紫外灯下切取HCMV DNA电泳条带，参照分子克隆实验指南回收凝胶中DNA。

　　限制性核酸内切酶的应用及消化产物的电泳：取2μg HCMV DNA样品加10U的限制性内切酶混匀，37℃作用2?h，然后65℃，10?min以终止反应。消化产物在0.8%琼脂糖凝胶内电泳，40V，16～18?h，电泳完毕后将凝胶置溴化乙锭溶液(1μg/ml)内染色30?min，取出凝胶于紫外灯下观察结果。

　　结果和讨论

　　112名学龄前儿童的尿标本共分离到50株病毒。其中F幼儿园76份标本，分离病毒阳性34份，阳性率为44.7%；G幼儿园为36份标本，病毒阳性16份，阳性率为44.4%。用McAb对分离毒株进行鉴定，显微镜下可观察到HCMV感染细胞的胞核呈棕褐色。用EcoRⅠ对分离到的HCMV毒株进行限制性酶切分析，结果显示：分离到的HCMV毒株主要表现为4种不相同的限制性酶切图谱，也有部分HCMV毒株具有完全相同的EcoRⅠ图谱(见图1)。从一位HCMV阳性的母亲尿标本中分离一株HCMV，经酶切图谱分析与儿童中的HCMV有差异，说明与患儿的HCMV不是同一来源限制性酶切图谱。

　　A、B、C分别表示自该幼儿园3个不同班组分离到的毒株，A1、A2酶切图谱相同；A3、B2、B3、C1、C2具有相同的酶切图谱，B1毒株则显示出与上述各不相同的酶切图谱，M: 分子量marker (λDNA)

　　由于HCMV可通过被带毒者唾液及尿液污染的玩具、手指使易感儿童受染，幼儿园儿童间密切接触是HCMV传播的重要条件。邵济钧等〔2〕通过372份HCMV活动性感染孕妇及其分娩胎儿脐血配对血清检测发现，青岛地区先天性HCMV总感染率为9.14%，这些感染儿童可自尿液、唾液等部位排毒达多年，是造成幼儿园儿童间HCMV水平传播的主要原因。

　　我们认为，流行病学上无相关性的HCMV分离毒株的限制性酶切图谱有明显差异，表明基因的核苷酸序列互不相同；而流行病学上相关的HCMV毒株则具有相同的酶切图谱，提示其基因序列相同。因此，根据限制性酶切图谱的特点，可以追踪HCMV感染的传染源，亦可确定是原发HCMV感染后体内潜伏病毒的再激活，还是外源性HCMV毒株引起的再感染。

参考文献

　　1，Griller L, Blomberg I. Restriction enzyme analysis of human cytomegalovirus using DNA extracted from infected cells. J Med Virol, 1984, 14:313-322.

　　2，邵济钧，王爱娟，强新，等.先天性巨细胞病毒感染与胎儿畸形关系的研究.青岛医学院学报，1988，24：109-114.