小鼠睾丸Ⅳ型胶原的合成与分布

　　摘　要　目的　研究小鼠睾丸内Ⅳ型胶原的合成与分布。方法　应用生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光法和原位杂交法检测幼年、成年及老年小鼠睾丸内Ⅳ型胶原的合成与分布的变化。结果　小鼠睾丸支持细胞具有合成Ⅳ型胶原的功能，小鼠睾丸曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的含量及支持细胞内Ⅳ型胶原mRNA水平随小鼠年龄的增加而变化。15天幼鼠睾丸内含量最高，成年及老年小鼠睾丸内含量依次减少。结论　睾丸内的细胞外基质可能在生精过程中起重要作用。

　　关键词：胶原　睾丸　间接免疫荧光　原位杂交

　　睾丸内的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)主要包括纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)、层粘连蛋白(laminin，LN)、巢蛋白(entactin)、SPARC(secreted protein，acidic，and rich in cysteine)、蛋白多糖和Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原等［1～4］，与精子发生和生精细胞的分化具有密切关系，曲细精管基膜是睾丸内ECM的主要分布位置，Ⅳ型胶原是基膜内含量最丰富的ECM成分。在睾丸内，支持细胞(Sertoli cell，SC)和管周肌样细胞(Peritublar cell，PC)可以产生ECM［5］。本研究采用生物素-抗生物素蛋白DCS(avidin D cell sorter)体系间接免疫荧光法和原位杂交法检测各年龄段小鼠睾丸内Ⅳ型胶原的合成与分布，以阐明ECM在生精过程中的重要作用，并试图对其作用机制进行初步探讨。

　　1　材料和方法

　　实验分组　体内实验：实验动物为昆明小鼠，按年龄分为4组：(1)新生鼠，出生后5 d; (2) 幼鼠，出生后15 d； (3) 成年鼠，3个月； (4) 老年鼠，18个月。体外实验：培养的支持细胞来自出生后10 d的昆明小鼠。各年龄段使用动物数8～12只。

　　支持细胞的分离与培养　支持细胞分离参照Hadley等［6］方法进行。用培养液悬浮细胞，用吸管将细胞接种在有盖玻片的培养瓶内，于31℃，5%CO2条件下培养10～14 d。分离培养的细胞存在核卫星小体，可鉴定为支持细胞。

　　生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色

　　组织切片的生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色：参照许增禄［7］法。应用兔抗小鼠Ⅳ型胶原为第一抗体，生物素化的山羊抗兔IgG为第二抗体。染色后滴加甘油封片剂(含10%PBS和1%对苯基二胺)封片，OLYMPUS反射式荧光显微镜下观察，Kodak 400ASA胶卷照相。

　　体外培养的SC生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色：将长有SC的盖玻片从培养瓶内取出，D-Hank液洗1次，放入丙酮固定20 s，PBS洗2次，每次5 min，然后加用PBS配制的10%山羊血清于4℃孵育20 min，以下操作同上。

　　原位杂交

　　cDNA探针的制备：含小鼠α1(Ⅳ)cDNA(1.8 kb)的重组质粒PE123由预防医学科学院劳动卫生研究所刘秉慈教授惠赠。按文献［8］方法转染细菌后，大量制备质粒，用相应内切酶酶解质粒后，再用低融点琼脂糖法回收cDNA片段。

　　缺口平移法标记探针：应用缺口平移试剂盒(华美公司)，依照说明书将α-35S-dATP标记到探针上，标记探针经Sephadex G-50柱层析后回收，标记探针的比活性达2.78×106Bq/μg。

　　组织cDNA-mRNA原位杂交：采用林月珍等［9］方法。

　　新鲜睾丸组织制成冰冻切片，经原位杂交后，放射自显影及HE复染，树胶封片，OLYMPUS光学显微镜观察，Kodak 100ASA胶卷照相。

　　体外培养的SC的原位杂交：将长有SC的盖玻片从培养瓶内取出，直接放入PBS配制的4%多聚甲醛中固定20 min，以下操作同组织cDNA-mRNA原位杂交。

　　阴性对照标本的设置：

　　A.杂交液中无标记探针的空白对照。

　　B.以标记的λDNA代替目的探针。

　　原位杂交结果的半定量及统计学处理：每个动物取1张切片，则每个年龄组为8张切片，在每张切片上取左上、右上、中、左下、右下5个区域(n=40)，在400×下计数银颗粒数，结果以银颗粒数/10000 μm2表示。实验数据以均数±标准差(±s)表示，用t检验进行组间比较，P＜0.05为差异有显著性意义。

　　2　结果

　　细胞免疫化学结果

　　组织切片的生物素-抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色结果：5天小鼠曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的荧光最弱，呈薄层状围绕曲细精管，血管基膜处亦有荧光存在(图1a)，15天小鼠睾丸曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的荧光最强(图1b)，3及18个月小鼠睾丸曲细精管基膜内Ⅳ型胶原的荧光依次减弱(图1c)。对照染色标本未见荧光。