突变受体阻断NIH3T3细胞中rhBMP-2诱导的信号转导

　　在脊椎动物中胚层的发育诱导过程中，骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是重要的背-腹化发育促进因子。BMPs在细胞表面与BMP的Ⅰ、Ⅱ型受体相互作用。为研究BMPs信号转导在组织发育和细胞分化中的作用，我们以BMPs Ⅱ型突变受体的cDNA为目的基因，以NIH3T3细胞为载体细胞，构建了稳定表达BMPs Ⅱ型突变受体的细胞株。从而为从信号转导水平探讨BMPs对细胞分化及组织器官发育的调控作用奠定了基础。

　　一、材料和方法

　　1.材料：pC-4真核表达载体(含BMPs Ⅱ型突变受体cDNA); FuGENE6 Transfection Reagent Kit购自Boehringer Mannheim; rhBMP-2由军事医学科学院基础医学研究所生化实验室提供。

　　2.方法：①稳定表达BMPs Ⅱ型突变受体的细胞的构建：用FuGENE6 Transfection Reagent Kit真核转染试剂盒将pC-4真核表达载体转染NIH3T3细胞，用G-418和neo基因探针筛选出细胞克隆。②在培养板上接种两组转染细

　　胞，一组在含10%胎牛血清的DMEM、标准环境中培养，另一组在培养液中加入rhBMP-2 50 μg/L。利用细胞生长曲线、MTT检测、流式细胞仪检测、BrdU检测等观察细胞的增殖和DNA合成；利用ALP检测试剂盒及OC检测试剂盒观察细胞是否有成骨趋向。设未转染细胞及空白对照。对结果进行统计学分析。

　　二、结果

　　1.加入rhBMP-2 50 μg/L后，未转染细胞体积变小，由梭形向多角形转化；而转染细胞未见明显变化。

　　2.细胞生长曲线、MTT检测、FCM分析、BrdU检测显示：加入rhBMP-2 50 μg/L后，未转染细胞DNA合成变慢，细胞增殖力下降，与加药前差异有显著性；而转染细胞加药前后差异无显著性。

　　3.ALP检测及OC检测结果显示，加入rhBMP-2 50 μg/L后，未转染细胞的ALP活性增高，OC值比加药前变高；而转染细胞加药前后差异无显著性。

　　三、讨论

　　BMPs是TGF-β超家族成员，其在胚胎发育、器官形成中的重要作用日益为人们所认识。TGF-β超家族的成员都结合两种特异受体发挥作用，分别叫做Ⅰ型及Ⅱ型受体。这些受体都有保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。BMPs在细胞表面与Ⅰ、Ⅱ型受体相互作用。受体与配体结合的特异性主要取决于Ⅱ型而非Ⅰ型受体。

　　BMPs活性二聚体与受体复合体结合，导致Ⅰ型受体的磷酸化，Ⅰ型受体再作用于Smad 1或Smad 5。Smad 1或Smad 5被激活后再结合Smad 4，该复合物进入胞核后，再作用于下游因子，影响一些特定基因的转录，参与细胞内生理活动。促使Ⅰ型受体的磷酸化是信号传导所必需的。Ⅱ型受体激酶结构域突变导致受体复合物中的Ⅰ型受体未被磷酸化，那么BMP的信号不能被传导。

　　为研究BMPs信号转导在组织发育和细胞分化中的作用，我们构建了BMPs Ⅱ型突变受体的真核表达载体，命名为pC-4。用真核转染方法建立了稳定表达BMPs Ⅱ型突变受体的细胞株。结果显示，转染细胞加入rhBMP-2后，其形态、活力、ALP活性及OC含量都有显著性变化，而未转染细胞在加入rhBMP-2后差异无显著性。这说明rhBMP-2的信号转导被BMPs Ⅱ型突变受体阻断了。

　　pC-4真核细胞表达载体可用于研究BMPs信号对间充质细胞分化的调控，对于研究和阐明BMPs信号转导在组织发育和细胞分化中的作用具有重要意义。