中性粒细胞趋化因子基因表达增强在内毒素大鼠急性肺损伤发病中的作用

　 　　观察内毒素致大鼠急性肺损伤发生过程中肺组织细胞因子诱生的中性粒细胞趋化因子（CINC）基因表达水平变化，并分析其在急性肺损伤发生中的作用。

　　材料与方法　模型复制及动物分组：健康雄性SD大鼠28只，体重200～300 g。将其中16只大鼠随机分为以下两组：（1）正常对照组（8只）；（2） 内毒素损伤2 h组（8只）。每组动物观察2 h。另取12只大鼠随机分为3组，每组3只，分别为内毒素损伤后4、6和8 h组，以动态观察内毒素的致伤作用。采用腹腔注射LPS（2 mg/kg体重）复制大鼠急性肺损伤模型。到时间后摘眼球放血，处死大鼠。收集血清行外周血白细胞计数。采用放免法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)。开胸取2小块肺组织，分别送光镜和电镜检测，其余肺组织待检CINC基因表达。肺组织CINC基因检测采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法。PCR反应条件：94 ℃，15 s ；58 ℃，30 s；72 ℃，18 s。执行35个循环。最后延伸，72 ℃，10 min。电泳结束时对电泳带进行扫描，用LEICA计算机图像分析系统测扩增产物的灰度值，以β-actin为内参照，计算CINC mRNA的相对含量。

　　结果　病理观察：正常对照组大鼠肺泡结构清晰。LPS注射后2 h，肺泡壁充血、增厚，肺间质和肺泡腔内均可见大量炎性细胞浸润。电镜观察示肺泡Ⅱ型上皮细胞微绒毛减少甚至消失、线粒体空泡形成，并可见板层小体排空增多（图1～3）。LPS损伤后大鼠外周血白细胞计数、血清TNF-α和肺组织CINC mRNA等指标的变化，见表1。

　　内毒素损伤2 h组大鼠外周血白细胞计数明显低于其它组(P＜0.05)；4 h组外周血白细胞计数明显低于对照组和8 h组(P＜0.05)；内毒素损伤2 h组、4 h组外周血PMN计数明显低于对照组(P＜0.05)，与6 h、8 h组比较(P＜0.01)；内毒素损伤2 h组血清TNF-α明显高于其它各组(P＜0.001)；内毒素损伤2 h组肺组织CINC mRNA表达水平明显高于其它各组(P＜0.001)；4 h组肺组织CINC mRNA表达水平明显高于对照组(P＜0.05)。

　　讨论　CINC在急性肺损伤发生过程中所起作用已引起有关学者的重视。Blackwell等［1］通过Northern斑点分析发现，在内毒素大鼠急性肺损伤发生过程中，肺组织CINC基因表达增强。我们采用RT-PCR法检测肺组织CINC mRNA表达也发现，内毒素损伤后2 h大鼠肺组织CINC mRNA表达显著强于对照组。CINC是大鼠中性粒细胞特异性趋化因子，体内研究显示［2］，给大鼠皮下注射10-10～10-7M的CINC可引起注射局部中性粒细胞浸润，且呈剂量依赖性。本组研究还表明，腹腔注射内毒素引起肺组织CNIC基因表达增强，伴随外周血以PMN为主的白细胞计数下降和肺组织中以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润增多。证实内毒素可致肺组织CINC表达增强，后者通过趋化中性粒细胞而参与急性肺损伤发病过程。

表1　各组各项指标的变化（±s）

时间	只数	外周血白 　　细胞计数 　　(×109/L）	外周血 　　PMN计数 　　（×109/L）	血清TNF-α 　　(ng/ml)	肺组织 　　CINC mRNA 　　表达水平
对照组	8	5.5± 　　1.9	3.1± 　　1.2	0.13± 　　0.04	0.03± 　　0.06
内毒素 　　损伤组	8	2.6± 　　0.9	1.0± 　　0.3	2.85± 　　1.16	0.51± 　　0.16
2 h组
4 h组	4	2.9± 　　1.2	1.5± 　　1.0	1.21± 　　0.35	0.26± 　　0.05
6 h组	4	4.9± 　　1.4	3.4± 　　1.3	0.84± 　　0.34	0.15± 　　0.06
8 h组	4	5.6± 　　1.2	3.7± 　　1.4	0.14± 　　0.05	0.07± 　　0.05

 

图1　正常大鼠肺组织结构　HE　×20

 

　图2　内毒素损伤组肺泡壁和肺泡腔可见大量炎性 细胞浸

　　润　HE　×40

 

图3　内毒素损伤组Ⅱ型上皮细胞板层小体排空 增多

　　醋酸铀柠檬酸铜双重染

　　色　×800

参考文献

　　1.Blackwell TS,Holden EP,Blackwell TR,et al. Cytokine-induced neutrophil chemoattractant mediates neutrophilic alveolitis in rats :association with nuclear factor κB activation .Am J Respir Cell Mol Biol，1994，11:464-472．

　　2.Watanabe K, Koizumi F, Kurashige Y,et al. Rat CINC, a member of the interleukin-8 family, is a neutrophil-specific chemoattractant in vivo. Exp Mol Pathol, 1991, 55:30-37．