人S-100β的体外表达及其对SK-N-SH神经元细胞增殖作用的研究

　　S-100 β是一种神经胶质细胞分泌的钙活性蛋白质，最近的研究提示,S-100 β具有神经营养活性,并可能参与海马神经元长时程电位的形成。我们在构建人S-100 β cDNA的重组质粒、体外表达、纯化后获得重组人S-100 β的基础上，观察其对培养的SK-N-SH神经元细胞的神经营养活性。

　　方法：　(1) 重组质粒经异丙基硫代-β-半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达获得重组人S-100 β。(2) 表达产物经DEAE-52离子交换纤维素柱层析和苯基琼脂糖凝胶CL-4B(Phenyl-Sepherose CL-4B)疏水柱层析分离纯化［1］，表达产物经蛋白印迹法证实为人S-100 β。 (3) 重组人S-100 β单体经浓缩后，加入CaCl2，-20℃下形成活性二聚体，0.22 μm 过滤灭菌，制备成S-100 β活性二聚体溶液，在96 孔细胞培养板上种植细胞密度为500/ml的SK-N-SH细胞，培养基内加入浓度分别为0、20、40、60、80、100 μg/ml 的S-100 β活性二聚体溶液，分别培养24、48、72、96 h，每时间浓度组12孔。以镜下形态学观察及酸性磷酸酶活性(APA)法检测S-100 β活性二聚体溶液对SK-N-SH的增殖作用。

　　结果：　(1) 镜下形态学观察，60 μg/ml重组S-100 β活性二聚体溶液下SK-N-SH培养48、72 h后，神经元细胞增殖加快，表现为细胞附壁增加，体积增大，数目增多，突起增多延长。(2) APA法检测结果见表1。

　　讨论：　神经系统的变性疾病及各种毁损性疾病可导致神经元细胞的死亡和各种神经功能的缺损。由于神经元细胞的再生能力极弱，人们长期致力于寻找和开发促进神经元细胞生长和增殖的物质。将重组人S-100 β二聚体溶液加入神经元培养基内，通过镜下形态学观察和酸性磷酸酶活性检测，均证实其对体外培养的SK-N-SH神经元增殖有促进作用，进一步证实S-100 β的神经营养作用，为进一步研究S-100 β对原代神经元细胞生长的影响，神经细胞损伤的保护作用以及其神经营养作用的胞内信息传递机制打下了基础。

表1　S-100 β活性二聚体溶液对SK-N-SH细胞增殖的影响（A450）

培养时间

　　(h)
 S-100 β活性二聚体溶液浓度（μg/ml）
0 20 40 60 80 100
24 0.016±0.009 0.031±0.007**
 0.065±0.035**
 0.073±0.023**
 0.074±0.017**
 0.098±0.027**
 
48 0.040±0.004 0.079±0.033* 0.125±0.024** 0.113±0.010** 0.215±0.109** 0.242±0.050**
72 0.057±0.010 0.109±0.018** 0.157±0.036** 0.279±0.039** 0.340±0.092** 0.351±0.075**
96 0.083±0.004 0.170±0.012* 0.224±0.075** 0.380±0.057** 0.402±0.266** 0.398±0.069**

　　注：各处理组与非处理组经非参数q′检验， * P＜0.05； ** P＜0.01 基金项目：安徽省自然科学基金资助项目(96-医-09)

参考文献

　　1，周青, 汪凯, 刘虎, 等. 人S100 β表达载体的构建,体外表达和表达产物的纯化. 安徽医科大学学报， 1999,34,8-10.