骨和软骨组织工程中细胞种植基质材料的研究进展

　　提要 组织工程学是近年发展起来的一门新学科。其中，骨和软骨组织工程的研究进展较快，已成功修复了骨和软骨缺损及预制了预先设计形态的软骨。本文就近年来骨和软骨组织工程中采用的各种细胞种植基质材料的特性、优缺点和应用前景等方面作一综述。

　　目前，骨的软骨组织工程的研究主要包括：（1）细胞种植基质材料的研究开发；（2）种子细胞性质的研究；（3）组织培养中各种因子的调控作用。其中，细胞种植基质材料的研究是组织工程研究的重点内容，也是能否应用于临床的重要因素之一。本文就此内容作一综述。

　　细胞种植基质材料的来源有两类：人工合成的细胞种植基质材料和天然的细胞种植基质材料。

　　1 人工合成的细胞种植基质材料

　　 理想的细胞种植基质材料应具备以下5个条件。（1）良好的组织相容性：材料应对种子细胞和邻近组织无免疫原性。（2）具有三维立体结构：材料必须是高度多孔的（孔率为80%以上、类似泡沫状），从而具有很大的内表面积，有利于细胞的植入和贴附，以及细胞营养成分的渗入和细胞代谢产物的排出。（3）生物可降解性和降解率：材料应是可吸收的，在组织形成过程中逐渐分解，从而不影响新形成组织的结构和功能。降解率应与组织生长率相结合。（4）良好的细胞界面：材料应具有良好的表面活性，有利于细胞的贴附，并为细胞在其表面生长、增殖、分泌基质提供良好的微环境。（5）可塑性和机械强度：材料可被加工成所需要的形状，并有一定的机械强度，在植入体内后的一定时间内仍可保持其形状，从而使新形成的组织具有一定的外形[1，2]。

　　 目前，用于骨和软骨组织工程的材料有磷酸三钙（tricalcium phosphate,TCP）、羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）、煅石膏（plaster of paris,PP）、聚酣（polyanhydrides）、聚乙烯、聚乳酸（polylatic acid,PLA）和聚乙醇酸（polyglycolic acid,PGA）等。应用最为广泛的是有机高分子聚合物中的PGA和PLA，这两种聚合物具有良好的生物相容性、可降解性和可吸收性，在体内以水解的方式降解产性天然的中间代谢产物排出体外。材料的吸收率可以通过共聚单位的相关比率来控制，降解时间可达数月至数年，被称为人工合成生物相容性、生物可降解性聚合物。聚合物具有一定的可塑性，Mikos等[3]成功地应用层压技术合成了具有精细解剖形状的三维立体生物降解性聚合物泡沫，可制成特定形状，孔率达90%。这种聚合物模板作为基膜为植入细胞提供附着，并成为移植复合物的内在结构，控制和调节植入细胞的环境和生长。使用人工聚合物可以不断地向聚合物增加侧链，这样在聚合物分解后仍可向细胞输送营养和激素[4]。现今，应用最广泛且取得最佳效果的聚合物材料为以PLA包埋的、由直径15μm、厚度100μm、间隔150～120μm的PGA纤维组成的无纺网[5]。但是，此种无纺网亲水性差，对细胞吸附力弱，因此Mikos等[6]通过乙醇和水两步预湿方法，对细胞支架进行有效预湿，增加了亲水性，促进软骨细胞在细胞支架表面的均匀分布，并将有利于体内移植后纤维血管组织的长入和三维立体软骨基质的形成。Bujia等[7]选择多聚赖氨酸来包被PLA聚合物，实验证明多聚赖氨酸除具有增加支架对细胞的吸附力外，还具有促进细胞功能的作用。以多聚赖氨酸包被支架使细胞均匀分布于支架纤维之间和支架表面，充分利用支架空间，从而更好地发挥细胞的功能。但PGA和PLA降解后的酸性代谢产物会降低聚合物周围pH值，从而影响细胞和组织的生长[8]。Agrawal等[9]则采用碱性盐（包括碳酸钙、HA和碳酸氢钠复合PLA-PGA移植物）来拮抗酸性降解产物对周围pH值的的降低。实验发现，植入9周后碳酸钙组、HA组和碳酸氢钠组的pH值分别为7.4～6.3、4.3～6.9和4.5～8.2，而单独PLA-PGA对照组的pH值仅为3.0；并且移植物在复合碳酸钙、碳酸氢钠中移植3周后明显比在单纯PLA-PGA中生长迅速。

　　 尽管有许多改进，PGA和PLA聚合物仍存在费用昂贵、降解率低、可塑性不令人满意的缺点。实验证明，软骨生成后直至28天在标本中仍可发现成束的PGA聚合体，可引起纤维化及可能发生周围组织的免疫反应[10]。

　　Keith等[11]采用藻酸钙包埋软骨细胞凝胶化后制成软骨细胞-藻酸钙复合物，移植于小鼠皮下以产生新的软骨。藻酸是一种从海藻中提取的带有二价阴离子的多糖，与带有二价阳离子的钙离子通过离子交联形成开放的网状藻酸钙离子水凝胶。藻酸钙作为聚合物基质，为软骨细胞生长提供三维空间结构并能保持复合物的形状。藻酸钙与PGA、PLA等聚合物相比具有更好的亲水性和塑形能力，更容易生成预先设计的组织工程软骨，但仍存在可吸收性差和免疫原性的问题。

　　 Sims等[12]采用聚氧乙烯水凝胶包埋软骨细胞形成软骨细胞-聚合物复合物，注射到裸鼠皮下培养6～12周后形成新的软骨。聚氧乙烯在高分子量和高浓度情况下形成具有可塑性的粘性物质，它与蛋白质和大部分生物大分子不发生作用，几乎可认为无免疫原性和抗原性。并且，经过化学修饰（增加氨基酸和丙烯基侧链）的聚氧乙烯水凝胶在紫外线作用下能够从液态转为预定结构的固态物质。聚合物在体内6～8周同周围组织吸收后经肾脏排泄。这些特性说明，聚氧乙烯是一种理想的细胞种植材料，其注射植入的方法使创伤达到最小程度。

　　2 天然的细胞种植基质材料

　　2.1 天然细胞外基质

　　组织由细胞和细胞外基质（ECM）组成，ECM包括均质状态的基质（蛋白多糖和糖蛋白）和细丝状的纤维。ECM是细胞附着的基本框架和代谢场所，其形态和功能直接影响所构成的组织形态和功能。天然ECM可作为组织工程中的细胞种植基质材料。

　　胶原为纤维的组成部分，是天然ECM的重要成分。Stone等[13]研究证实，采用胶原支架作为模板能够支持软骨细胞生长及合成基质，生产出在大体上、组织学和生物特性三方面都与犬半月板相似的软骨。在此基础上对9例患者进行了临床一期预实验研究。将牛跟腱经纯化得到胶原I（pH2.5～3.0），胶原膨胀和匀化后，经0.6%NH4(OH)处理后脱水、塑形、化学交联和灭菌得到胶原支架移植物。这种移植物的密度平均为（0.2±0.02）g/cm2,孔径为75～400μm，抗拉力平均0.5～2.5kg，间隙空间达到牛血清蛋白分子的98%±5%，平均收缩温度为67℃±3℃。这种胶原支架具有以下特性：良好的生物相容性；适于细胞生长的孔径；营养细胞的大分子易于通过；移植前可预先塑形；移植过程保持适当的机械强度；具有作为细胞生长模板的稳定性。胶原支架的安全性通过了评估，其中包括毒性、无菌程度、溶血性、致热原性的检测以及在两种动物模型中牛胶原I的免疫原性的检验。9例患有半月板撕裂或缺失的志愿者参加了实验，将移植物植入患者膝关节中3～6个月后，二期关节镜检证明胶原支架被吸收，替代以新形成的软骨组织。36个月后，9例患者症状减轻，未发生免疫反应。MRI证实，3、6、12、36个月形成的半月板中存在进行性的软骨成熟信号。实验证明，胶原支架是一种可移植的、安全且能够支持软骨细胞生长的基质材料。

　　Sims等[10]利用纤维蛋白单体在凝血酶作用下形成凝胶的天然过程制成纤维蛋白凝胶，用凝胶包埋软骨细胞作为软骨细胞生长的基质材料，纤维蛋白来自血液的冷沉淀物。聚合后的纤维蛋白凝胶具有生物相容性、可塑性好、吸附性强的优点，并且可通过降低凝血酶浓度延缓聚合过程，为移植物的塑形提供更充分的时间。另外，纤维蛋白凝胶通过释放转化生长因子-β和血小板衍生生长因子刺激间充质细胞的趋化和细胞有丝分裂。实验证明，纤维蛋白凝胶作为细胞种植基质材料，较人工合成聚合物（如PGA、PLA无纺网等）更有生物活性及更经济。并且因来自自身血液，避免了免疫原性问题，有巨大的应用潜力。

　　应用不同技术制作同种异体或异种骨和软骨的天然ECM，也可作为组织工程中细胞种植的基质材料，包括烧结骨、同种异体脱钙骨或脱矿骨基质、脱蛋白骨、重组合异种骨。以上材料分别经过脱钙、去脂、去蛋白等处理，去掉一些杂蛋白和有阻滞作用的脂质成分，降低了抗原性，并且具有良好的组织亲和性和结合力。其天然的密集微孔结构具有骨生长支架作用，为细胞的增殖、分化、成骨提供天然成分，常与骨形态发生蛋白等生长因子复合后促进细胞生长和分化增殖，具有良好的骨诱导活性。同种异体脱钙骨的吸收与新骨的生长速度基本同步，为新骨的生长提供了支架又不影响新骨的塑形。脱蛋白骨保留一定弹性，易被制成各种形状较紧密地嵌进骨缺损空间并有支撑作用。这些材料作为骨移植替代物已有较多研究，并在临床应用中取得了初步疗效[14，15]。

　　2.2 自然界的细胞外基质替代物

　　生物珊瑚因具有类似无机骨的微孔结构和组成成分（碳酸钙）而引起广泛注意，它具有良好的生物降解性，植入体内6周可被降解50%，12周可被完全降解。生物珊瑚有一定的机械强度，可加工成各种形状，其三维结构有利于成骨细胞的长入、增殖及分化，用于临床治疗骨缺损已有10多年，rhBMP-2/珊瑚复合人工骨是一种较理想的骨移植替代材料[16]。珊瑚拥有上述特点加之来源丰富，作为细胞种植基质材料具有很大的潜力。

参考文献

　　1 Mikos AG,Sarakinos,G,Lyman MD et al.Biotech bioeng,1993;42;716-724

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　　3 Mikos AG,Sarakinos G,Leite SM et al.Biomaterials,1993;14(5):323-330

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　　11 Keith TP,Linda GC,Yaremchuk MJ et al.Plast Reconstr Surg,1996;97(1):168-178

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　　13 Stone KR,Steadman JR,Rodkey WG et al.J Bone Joint Surg Am,1997;79(12): 1770-1777

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　　15 Johnson EE,Urist MR,Finerman GA.Clin Orthop,1992;277:229-237

　　16 Gao TJ,Lindholm TS,Kommonen B et al.Int orthop,1997;21(3):194-200