琼脂胰岛素对体外培养人鼻中隔软骨细胞生长增殖的影响

　　观察琼脂包埋培养皿后鼻中隔软骨细胞体外单层培养的生长状况，将胰岛素作用于鼻中隔软骨细胞，了解其对软骨细胞生长的影响，为软骨组织工程提供理论参考。

　　一、材料和方法

　　1．软骨细胞的培养：无菌条件下取10例鼻中隔偏曲手术患者鼻中隔软骨，PBS液（含青霉素200 U/ml，链霉素200 μg/ml）漂洗3次，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小软骨碎片，PBS液漂洗2次，加入2倍体积的Ⅱ型胶原酶（3 mg/ml，sigma公司，美国），37℃恒温震荡消化，过滤，离心，PBS液漂洗2次，离心，弃上清，1640培养基(sigma，美国。含20%新生牛血清，50 mg/L维生素C，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素，292 mg/L谷氨酰胺)悬浮细胞，血细胞计数器计数，调整细胞密度至3×105/ml，接种于培养瓶中，于37℃、含5%CO2的饱和湿空气中培养。

　　2.培养器皿的包埋: 取34 g琼脂，加入1 000 ml蒸馏水微加热使溶解，高压蒸汽灭菌，备用。使用时加热使之溶解，适量倒入培养皿表面，自然冷却凝固。使用前PBS冲洗2次，紫外线消毒。

　　3.胰岛素最佳作用浓度的测定:取生长状态良好的第2代软骨细胞，调整细胞密度，接种于96孔培养板，每孔细胞数为103个，共接种30孔。胰岛素终浓度按0、1、10、100、1 000、10 000 U/L(分别为对照组和1～5组)各加入5孔，每孔培养基总量为200 μL 。体外培养3 d后，每孔吸出 20 μL培养液，加入20 μL MTT（2 mg/ml），继续培养 4 h，吸出培养液，加入 DMSO 150 μL，微孔板振荡器上振荡 10 min，500型酶标仪以 405 nm为测定波长，以 655 nm为参考波长，测定各孔吸光度（A）值。由于活细胞中的脱氢酶能将MTT还原为不溶于水的蓝色产物甲月　赞（formazan），并沉淀于细胞中，二甲亚砜（DMSO）能溶解甲月　赞，溶液的颜色深浅即可代表活细胞数，测吸光度即可得知细胞的生长增殖情况。

　　4．生长曲线的观察：取生长状态良好的第2代软骨细胞，调整细胞浓度1×104/ml，接种 7块 96孔培养板，每板接种 20孔，其中10孔琼脂包埋，接种细胞同上。每块板包埋与无包埋分别 5孔与含胰岛素（最佳浓度）的培养基作用，5孔以原培养基作用隔日换液。每24 h取 1块培养板，各组分别计数5孔细胞数，取其均值做为该组与该日细胞生长增殖数目，连续计数7 d，观察其生长曲线。

　　5．统计方法：F检验及Dunnett-t检验。

　　二、结果

　　1．软骨细胞的生长状况：人鼻中隔软骨细胞接种于培养瓶中之后，12 h即有细胞贴壁，24 h绝大部分细胞贴壁。36 h后细胞细胞体积增大，胞浆伸出突起，细胞向多角形变化。琼脂包埋培养器皿表面后，软骨细胞，始终保持圆形形态，细胞生长繁殖往往集簇成团，传至第4代仍保持其圆形形态。

　　2．胰岛素的最佳作用浓度：对照组和1～5组的A(±s)分别为：0.039±0.004 3，0.046±0.005 2，0.052±0.007 6，0.050±0.007 8，0.039±0.005 4，0.038±0.003 7。经F检验：各组之间有显著性差异（P＜0.01），Dunnett-t检验：2、3组与对照组之间差异有显著性（分别为P＜0.01、P＜0.05）。即当胰岛素浓度在10～100 U/L时可明显促进人鼻中隔软骨细胞的生长。

　　3．软骨细胞生长曲线：各组接种24 h细胞无明显生长，3～5 d细胞呈指数生长，6 d以后细胞数目增长变缓，进入平台期。加入胰岛素组细胞增加明显多于未加胰岛素组（P＜0.05），琼脂可使细胞数目略有增加，但无统计学意义（P＞0.05）。

　　三、讨论

　　组织工程是近年来发展起来的一门新学科，其最基本的思路是在体外分离培养细胞，将一定量的细胞种植到具有一定空间结构的三维支架上，然后将此细胞-支架复合物植入体内或在体外继续培养，通过细胞间的相互粘附、生长繁殖、分泌细胞外基质，从而形成具有一定结构和功能的组织或器官。其中将一定量的细胞在体外培养扩增，达到相当的数量并保持表型的稳定，是形成新生组织的先决条件。

　　本实验证实琼脂包埋培养皿表面后，体外单层培养的软骨细胞传至 4代仍可保持其圆形形态，从而可以保持其表型的稳定。

　　本实验发现胰岛素浓度在10～100 U/L时，能有效地促进人鼻中隔软骨细胞的生长。

　　基金项目：广东省自然科学基金资助项目（990418）