增殖瘢痕成纤维细胞在低血清中增殖及生物合成功能的特性

　　本实验旨在研究不同异常瘢痕及正常皮肤成纤维细胞在低血清中增殖及生物合成功能的特性，探讨其对瘢痕形成的机制及指导治疗。

　　1．材料和方法：选病理学诊断为瘢痕疙瘩和增生性瘢痕及正常皮肤标本各6例，用细胞培养方法体外培养成纤维细胞(fibroblast,简称FB)，将培养后的各组细胞爬片置于含0.5％胎牛血清的DMEM培养液中培养7 d，取材。以含20％胎牛血清的DMEM培养液为对照组。经免疫组织化学、分子生物学等方法检测不同成纤维细胞在低血清条件下，增殖细胞核内抗原(proliferating cell nuclear antigen,简称PCNA)、p16、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白及前胶原基因表达。

　　2．结果：（1）免疫组织化学结果：PCNA和P16主要在细胞核表达，Ⅰ、Ⅲ型胶原表达于胞浆内。每例标本随机观察100个细胞，按着色深浅分为3级：深棕色为Ⅲ级，浅棕色为Ⅱ级，黄色为Ⅰ级。用权重方法计数，权重量化后的数目反映了每例标本的相对信号强度，用最小显著差法(LSD)进行统计学分析, 阴性对照未见阳性信号。瘢痕疙瘩FB PCNA 212.50±28.24，P16几乎阴性，Ⅰ型胶原195.00±40.17，Ⅲ型胶原151.33±18.50；增生性瘢痕FB PCNA 81.67±98.93，p16 28.17±37.31，Ⅰ型胶原120.83±68.41，Ⅲ型胶原94.67±58.79；正常皮肤FBPCNA 47.17±555.86，p16 116.33±63.43，Ⅰ型胶原87.67±52.76，Ⅲ型胶原79.00±31.97。

　　在低血清中三者FB PCNA、Ⅰ、Ⅲ型胶原表达强度变化为瘢痕疙瘩高于增生性瘢痕，增生性瘢痕高于正常皮肤，增生性瘢痕组中FB有3例表达PCNA，3例无明显表达；p16表达强度变化为正常皮肤高于增生性瘢痕，增生性瘢痕高于瘢痕疙瘩；正常血清中三者FB的PCNA、Ⅰ及Ⅲ型胶原表达强度相似，p16无表达。

　　（2）原位杂交结果光镜下观察蓝色信号为阳性信号，阴性对照未见阳性信号，根据实验结果将阳性信号分为Ⅰ和Ⅱ级，深蓝色和蓝色为Ⅱ级，浅蓝色为Ⅰ级。在低血清中90％瘢痕疙瘩FB有Ⅰ～Ⅱ级的Ⅰ型前胶原基因和Ⅰ级Ⅲ型前胶原基因表达；40％～50％增生性瘢痕FB有Ⅰ～Ⅱ级的Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因表达，30％～50％正常皮肤FB有Ⅰ～Ⅱ级的Ⅰ型前胶原基因表达，以Ⅰ级居多，40％～50％正常皮肤FB有Ⅰ～Ⅱ级的Ⅲ型前胶原基因表达。正常血清中瘢痕疙瘩FBⅠ～Ⅱ级的Ⅰ型前胶原基因表达，Ⅰ级的Ⅲ型前胶原基因表达；增生性瘢痕FB Ⅰ～Ⅱ级的Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因表达；正常皮肤FB仅有少量Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因表达。

　　3．讨论：PCNA与DNA复制及细胞增殖有关，表达量多反映细胞增殖能力强［1］，p16可诱导细胞停止于G1期，表达量多反映细胞增殖受到抑制［2］，Ⅰ、Ⅲ型胶原及相应前胶原基因的表达可反映细胞生物合成功能。本实验在低浓度血清培养的条件下三者FB PCNA、P16、Ⅰ、Ⅲ型胶原及Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因变化表明：瘢痕疙瘩FB增生活跃能持续生长，其生物合成功能旺盛；正常皮肤FB增殖能力受到明显抑制停止生长，其生物合成功能胶较弱；增生性瘢痕FB PCNA3例有表达，3例无表达的变化，其生物合成功能接近正常皮肤FB。根据上述现象提示，增生性瘢痕可能存在两种不同的亚群，一种为存在接触性抑制及密度抑制，一种为失接触性抑制及密度抑制，这两个亚群可能互相转化，而且这种转化很可能决定了增生性瘢痕的发生、发展及退化。临床上，增生性瘢痕的发生发展及退化的表现可能与细胞的转化有关。

　　已有报道证实瘢痕皮下组织氧分压只是正常组织的27％［3］。产生低氧分压是缺氧造成胶原蛋白的沉积导致血管阻塞而加重缺氧［4］。瘢痕疙瘩FB在低血清中的增殖及生物合成特性可能是在活体上瘢痕疙瘩持续增长的原因，因此瘢痕疙瘩形成后随局部有低氧低血供低营养状态，FB耐受低血清的特性决定了FB在活体上较差的营养环境中仍能持续增殖及不断合成胶原而引起胶原的不断沉积。增生性瘢痕FB的特性决定了当瘢痕增殖到一定程度，引起局部营养环境改变，FB能停止增殖及胶原合成。

　　参考文献：

　　［1］Keiman Z. PCNA: structure, functions and interaction. Oncogene, 1997,14:629-640.

　　［2］Lukas J, Parry D, Aagaad L, et al. Retioblastoma protein-dependent cell-cycle inhibition by tumor suppressor P16. Nature, 1995,375:503-506.

　　［3］Linares HA, Larson DL. Historical notes on the use of pressure in the treatment of hypertrophic scars or keloids. Burns, 1993,19:17-21．

　　［4］Ehrlich HP, Kelley SF. Hypertrophic scar: an interruption in the remodeling of repair: a laser doppler blood flow study. Plast Reconstr Sury, 1992,90:993-998.