血卟啉衍生物光动力作用杀伤人胰腺癌细胞的实验研究

 

　　摘　要：目的　探讨光动力作用(PDT)对体外培养的人胰腺癌细胞的杀伤效应。　方法　以2株人胰腺癌细胞系P3和SW1990为研究对象，采用血卟啉衍生物(HPD)作为光敏剂，用高压钠灯（功率密度25 mW/cm2)为光源，以系列浓度的HPD经不同剂量的光照后，用MTT法测定PDT对胰腺癌细胞的相对抑制率。　结果　随光敏剂浓度的升高和照光剂量的增加，光动力作用对细胞的相对抑制率逐渐增大，在低光动力剂量下明显上升，随后上升渐趋缓慢达平台期；相同光动力剂量下，PDT对2株细胞的相对抑制率存在明显差异(P＜0.01)，LD90剂量条件亦不同。　结论　光动力作用对体外培养的人胰腺癌细胞具有明确的杀伤效应，其对细胞的相对抑制率具有显著的剂量效应关系；2株人胰腺癌细胞对PDT的敏感性不同。

Photodynamic therapy of hematoporphyrin derivative on human pancreatic carcinoma cell lines

ZHAO Yupei, YANG Bo, ZHANG Taiping

　　（Department of Surgery,Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100730, China.）

　　Abstract：Objective　To observe the effect of photodynamic therapy(PDT)on human pancreatic carcinoma cell lines in vitro.　Methods　Two lines of human pancreatic carcinoma cell P3 and SW1990 were studied to investigate the killing role of PDT with hematoporphyrin derivative(HPD) as photosensitizer and sodium lamp as light source. The cultured cells were treated with serial concentrations of HPD followed by irradiation of different dosages of visible light, then MTT colorometric assay was applied to measure the relative inhibitory rate of PDT for the cells.　Results　The relative inhibitory rate of PDT for the cells elevated along with the increase in the concentration of sensitizer and dose of light. Under the low photodynamic dose, it increased rapidly, and gradually slowed down to reach the plateau. Under the same photodynamic dose, significant difference in the inhibitory rate between the two lines was observed (P＜0.01), and the LD90 was also different.　Conclusions　PDT has a significant killing effect on human pancreatic carcinoma cell lines in vitro, and its relative inhibitory rate appears to be correlated with the dose of sensitizer and light irradiation. The sensitivity of the two cell lines to PDT is different.

　　Key words：Hematopor phyrin derivative；　Photochemotherapy；　Pancreatic neoplasms

　　由于胰腺癌早期缺少特异性症状， 发现比较晚， 现有治疗方法如手术、化疗和放疗等疗效均不佳。国外自80年代初开始探索将光动力治疗用于胰腺癌，并进行了一些细胞和动物实验研究。我们试图在细胞水平探讨光动力治疗对体外培养的人胰腺癌细胞的作用。

　　材料与方法

　　一、 材料

　　1．光敏剂：血卟啉衍生物(HPD)针剂:100 mg/20ml，主要吸收峰在320～500 nm，避光保存于4 ℃冰箱。

　　2．光源：高压钠灯：波长589 nm，总功率400 W，照射实验所用的功率密度为25 mW/cm2，照射距离为20 cm。

　　3．细胞系：(1)P3人胰腺癌细胞系：由北京协和医院病理科建立并提供使用。(2)SW1990人胰腺癌细胞系:自美国引进，由中国人民解放军总医院肿瘤生物研究室提供。

　　4．主要试剂：(1)RPMI-1640 培养粉：Gibco公司产品。(2)小牛血清：沈阳辉山生物制品厂产品，56 ℃ 30 min灭活，4 ℃冰箱保存。(3)TE消化液：为含0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸二钠的PBS溶液，经0.22 μm滤膜过滤除菌，－20 ℃冰箱保存。(4)MTT［3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氮唑蓝］为Sigma公司产品。溶于pH 7.4 PBS中配成5 mg/ml溶液，0.22 μm滤膜过滤除菌，4 ℃保存，2周内使用。

　　二、方法

　　1．细胞复苏、培养、传代和冻存：人胰腺癌细胞株P3和SW1990均为贴壁细胞。从液氮中取出冻存细胞，立即置于40 ℃水浴中，使细胞快速解冻，于含5% CO2和饱和湿度的37 ℃恒温孵箱中培养，以后2～3 d更换一次培养基，当细胞生长至80%～90%融合时传代，用TE消化液制成单细胞悬液，分装继续培养或移入冻存管置于液氮罐中冻存，亦可根据实验需要对细胞进行处理。

　　2．MTT法初筛接种96孔培养板的活细胞数［1］:MTT为四氮唑化合物,可溶于水，进入细胞后，可被活细胞线粒体脱氢酶切断四唑环，转变成一种不溶于水的甲化合物（formazan），死细胞内不会发生这种改变。

　　甲化合物可被异丙醇或二甲基亚砜等有机溶剂溶解，呈蓝紫色，用于吸光度测定，其OD值越高，说明细胞内酶的活力越大，活细胞越多。其吸收谱随细胞数和pH值而改变。取指数生长期细胞，消化后充分吹打成单细胞悬液计数后稀释成2×105/ml，将96孔培养板分为8组，每组6复孔，第1组取200 μl/孔细胞(4×104/孔)，然后倍比稀释6次至625个细胞/孔，第8组为单独加培养液的空白对照组。于37 ℃，5%CO2恒温孵箱中培养72 h，弃尽孔内培养液，加入5 mg/ml 的MTT每孔20 μl，用新鲜培养液稀释至200 μl，37℃温育4 h，弃尽培养液，加入DMSO 150 μl/孔，立即置微量振荡器上振荡5 min使甲化合物充分溶解，酶标仪(λ=570 nm)测OD值。重复3次实验取其均值,作OD值与接种细胞数的关系曲线，求相关系数r，选择出适宜的细胞接种浓度。

　　3．MTT法筛选PDT对P3和SW1990细胞系的作用参数:根据初筛结果，确定每孔接种的细胞数为2×104/孔，接种于96孔培养板，37 ℃，5% CO2孵箱中培养24 h贴壁。将1 mg/ml HPD 贮存液用RPMI-1640 完全培养基稀释至实验所需浓度：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 μg/ml共10个不同浓度。为照光方便每96孔板只接受同一种光剂量的照射，每种光剂量的实验重复3次，设以下5种照光剂量2、4、6、8、10 J/cm2。每板均设有纯培养基空白对照组，癌细胞对照组及实验组(不同浓度HPD)，每组6复孔。于接种细胞后24 h后弃去旧培养基，加入含不同浓度HPD的完全培养基200 μl继续培养24 h,换新鲜1640完全培养基后立即经不同剂量光照后培养72 h，MTT法测OD值计算相对抑制率。统计学分析，每株细胞得到5条曲线，选择适宜的LD90剂量条件。

　　结果

　　1．MTT法初筛接种的活细胞数：已知浓度的活细胞接种后,测定了接种活细胞数与MTT-甲化合物OD值之间的关系,经统计学处理,细胞数在104～4×104之间时,二者呈高度正向直线相关,r=0.983（P＜0.05）。因此将接种细胞数定在104～4×104个/孔为宜(图1)。

　　2．MTT法筛选PDT的作用参数：2株细胞经系列浓度的光敏剂及不同剂量的光照后，采用MTT法测定MTT-甲月　赞化合物的OD值，按如下公式计算细胞相对抑制率：

 

　　参照文献［2］报道的相对抑制率的评价，＞50%为敏感,30%～50%为中度敏感,＜30%为不敏感(耐药)。所见PDT的相对抑制率(表1，2)，随HPD浓度的增加和光剂量的增大而升高,在低光动力剂量下,抑制率曲线上升迅速,后渐趋缓慢达平台期。不同HPD浓度和不同光剂量间差异均有极显著意义(P＜0.01)。对2株细胞均表现为光剂量越大,达到平台期所需的HPD浓度越低,反之亦然。低光剂量2 J时,2株细胞相对抑制率与HPD浓度近似直线相关。同一光动力剂量(光敏剂浓度和光剂量的乘积)下, PDT对2株细胞的相对抑制率间差异有极显著意义(P＜0.01)。

表1　MTT法测定不同浓度光敏剂HPD-PDT对人胰腺癌P3细胞的相对抑制率(，%)

光剂量(J) 2 μg/ml 4 μg/ml 6 μg/ml 8 μg/ml 10 μg/ml 12 μg/ml 14 μg/ml 16 μg/ml 18 μg/ml 20 μg/ml P值*
2 12.43 23.15 31.44 31.44 45.06 45.87 65.15 75.85 90.11 95.46 0.0001
4 22.50 53.70 81.40 88.57 91.04 91.64 98.43 98.73 98.28 98.81 0.0001
6 38.84 82.41 90.12 92.57 95.10 96.66 98.51 97.92 97.25 97.25 0.0002
8 51.12 89.96 94.20 95.65 96.76 97.99 99.11 98.88 87.21 96.65 0.0006
10 68.93 92.66 92.99 95.48 95.93 97.63 98.19 98.31 98.19 98.19 0.0011

　　注：不同光敏剂浓度和不同光剂量组之间比较，P值均＜0.01

表2　MTT法测定不同浓度光敏剂HPD-PDT对人胰腺癌SW1990细胞的相对抑制率(，%)

光剂量(J) 2 μg/ml 4 μg/ml 6 μg/ml 8 μg/ml 10 μg/ml 12 μg/ml 14 μg/ml 16 μg/ml 18 μg/ml 20 μg/ml P值*
2 30.01 50.85 72.48 79.82 90.56 92.58 93.30 93.72 94.01 94.01 0.0001
4 84.07 86.23 86.17 87.90 91.11 92.65 92.41 95.37 95.42 97.07 0.0026
6 84.55 86.35 88.23 89.53 91.82 91.91 92.40 94.52 95.09 96.73 0.0016
8 89.19 91.72 94.43 94.93 95.10 98.51 98.51 98.80 99.10 99.10 0.0023
10 92.05 95.27 94.41 96.03 98.07 98.12 98.12 98.02 98.12 97.73 0.0048

　　注：不同光敏剂浓度和不同光剂量组之间比较，P值均＜0.01

　　讨论

　　近年来胰腺癌的发病率仍处于上升趋势，死亡率居高不下，已居肿瘤相关性死亡的第四位，临床上75%以上的胰腺癌患者确诊时已属中晚期，外科手术切除率不高，切除后的5年生存率很低，导致预后极差。传统的放疗、化疗等辅助治疗方法虽然在延长生存期方面起到一定作用，但由于对肿瘤选择性低，副作用较大，疗效并不尽人意。光动力治疗，以其良好的肿瘤特异性作用被人们重新认识，近20年迅速发展起来，成为很有希望的可用于多系统和多种组织类型肿瘤的局部治疗方法，现已证明对多种实体肿瘤有效［3，4］。但限于早期PDT的光穿透力的局限性，主要用于体表和腔内肿瘤，对胰腺、肝脏及腹腔内肿瘤的治疗起步较晚，相关研究也不多。

　　1．PDT对2株人胰腺癌细胞P3和SW1990的作用：本研究采用MTT法测定，结果证明确实存在明显的杀伤效应，与Ward等［5］观察到的PDT对亚硝酸胺诱导的叙利亚金黄仓鼠胰腺癌H2T细胞系的作用一致。说明PDT有应用于胰腺癌治疗的可能性。随着内窥镜和组织间光纤技术的发展，如果在体的胰腺组织对PDT有反应，那么从辅助治疗意义上讲，就有可能用于术中处理腹膜后淋巴结和切除区域残存的潜在病灶，以预防肿瘤的复发;或有可能对不能切除病例进行局部病灶治疗和处理腹膜后腹腔神经复合体，以缓解胰腺癌引起的顽固性疼痛。姑息性治疗上，有可能将可弯曲石英光纤通过内窥镜直接放置于胰胆管，以非手术手段缓解梗阻，避免对病人的手术创伤。

　　2．人胰腺癌细胞对PDT的反应：本研究观察到人胰腺癌细胞对PDT具有显著的剂量依赖性，其抑制率随光敏剂浓度的增加和光剂量的增大而升高，低光动力剂量下升高迅速，随后渐趋缓慢达平台期。说明此时既使再增加光动力剂量，也无益于疗效的提高，而且有可能因组织和血浆内光敏剂浓度的升高，带来不必要的副作用。实验结果也说明光敏剂浓度和光照剂量间存在交互关系，即一定范围内，为达相同的抑制率，可用较大的光敏剂浓度经较小的光剂量照射或较小的光敏剂浓度经较大的光剂量照射。例如:对于SW1990细胞株，以10 μg/ml HPD经2 J光照或4 μg/ml HPD经8J光照均可达90%杀伤率。由此提出了一个PDT治疗中如何选择适宜的光动力治疗条件的问题，这也是本实验的研究目的之一。大鼠实验性胰腺癌的光动力治疗研究发现［6］，随组织中光敏剂浓度的升高和能量剂量的增加，正常胰腺的可见性水肿加重，亦见十二指肠绒毛上皮和Brunner′s腺被完全破坏及肝细胞坏死等改变。许多研究已证明HPD的增加也会增加皮肤的光毒性反应，这是PDT治疗中最常见的副反应。Suzuki等［7］报道，激光能量超过100 mW/cm2时，除PDT作用外，亦存在激光热效应对肿瘤的杀伤作用，大量的研究已证明光动力治疗和热疗有协同杀伤肿瘤的作用，故从临床角度考虑，以选择较小光敏剂用量和较大光照射剂量的组合为宜。

　　3．胰腺癌细胞对PDT敏感性：本组2株胰腺癌细胞对PDT敏感性的差异显著，提示临床应用中，应注意不同病例采用不同光动力剂量的个体化问题。MTT法在许多肿瘤的化疗中被用作药物敏感性的检测，是一种简单、快速可以精确定量的半自动药物筛选法［7］。用于肺癌、胰腺癌［5］PDT敏感性的检测亦有报道。如有可能，可用MTT法选择PDT对不同肿瘤病人的适宜剂量，以更好地提高疗效，减轻副作用。

　　基金项目：高等院校博士学科点专项科研基金；“九五”国家科技攻关基金(96-907-03-05)

　　参考文献：

　　［1］Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal Immunological Methods, 1983,65:56-63.

　　［2］唐东平, 杨南武, 韦长元，等.MTT法对原发性肝细胞癌化疗药物敏感性的预测．实用癌症杂志, 1995,10:14-15.

　　［3］Marcus J, Glassberg E, Dimino EL, et al. Photodynamic therapy for the treatment of squamous cell carcinoma using benzoporphyrin derivative. J Dermatol Surg Oncol,1994,20:375-382.

　　［4］Loh CS,Bliss P, Bown SG, et al. Photodynamic therapy for villous adenomas of the colon and rectum. Endoscopy, 1994,26:243-246.

　　［5］Ward AJ, Matthews EK. Cytotoxic, nuclear, and growth inhibitory effects of photodynamic drugs on pancreatic carcinoma cells. Cancer Letters, 1990,102:39-47.

　　［6］Evrard S, Keller P, Hajri A,et al. Experimental pancreatic cancer in the rat treated by photodynamic therapy. Br J Surg, 1994,81:1185-1189.

　　［7］ Suzuki S, Nakamura S, Sakaguchi S,et al. Experimental study of intra abdominal photodynamic therapy. Lasers Medical Science, 1987,2:195-203.