骨髓微转移与乳腺癌预后

　　乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤（31％），其死亡率仅次于肺癌而位居第二[1]，且其发病率仍有逐渐升高趋势。恶性肿瘤细胞的转移是主要致死因素，而淋巴结转移和原发肿瘤大小是目前判断预后和制定治疗方案的主要参考指标。然而，仍有约24％经常规检查没有发现任何转移迹象的患者将于术后出现复发和转移[2]，说明单靠原发肿瘤大小和淋巴结转移状况来评估患者的预后，将影响对相当数量患者的正确判断。骨及骨髓是乳腺癌常见转移部位之一，约有80％以上的复发转移患者在疾病发展过程中出现骨转移，而目前现有的临床检查手段，包括X线、骨扫描、碱性磷酸酶和羟脯氨酸（hydroxyproline）检测等均欠敏感，只有当骨基质（bonematrix）出现破坏时才有意义。近年来，对乳腺癌患者处于亚临床阶段的骨髓微小转移灶的检测越来越受到肿瘤学家的重视，本文将有关资料作一综述。

　　1　骨髓微转移灶的检测方法

　　1.1常规细胞学检查

　　在无骨转移临床症状的患者，常规细胞学检查阳性率甚低。虽然多点骨髓穿剌活检是检测骨髓转移瘤的有效方法，但对微小转移灶的检测价值仍很有限，其最高阳性率仅为3.6％[3]。

　　1.2应用免疫组织化学（IHC）技术检测骨髓微转移

　　乳腺癌为上皮性肿瘤，具有上皮性来源的细胞生物学特征，而骨髓属间叶组织来源，本身无上皮性抗原的表达，故可应用针对上皮性抗原（如细胞角蛋白－CK、膜上皮抗原－EMA、表皮糖蛋白－EPG等）的单克隆抗体（MoAb）进行IHC染色。一旦骨髓成分中出现染色阳性细胞，再结合阳性细胞所具备的恶性特征，则很易作出骨髓微转移之诊断。

　　Osborne等[4]以乳腺癌细胞系（MCF－7）按不同细胞浓度与正常骨髓细胞相混合，然后行IHC染色，能检测出2×105骨髓细胞中的一个癌细胞，其检出率达95％，而常规细胞学检查全部为阴性。Molino等[5]利用三种不同方法（形态学方法、IHC和流式细胞分析）检测骨髓中的乳腺癌细胞（MCF－7），结果发现IHC方法的检测阳性浓度为0.00025％，而形态学分析和流式细胞技术检测出的阳性浓度分别为0.05％和0.2％，作者认为利用IHC技术检测骨髓微转移，无论是敏感性还是特异性方面，均优于其它两种方法。骨髓穿剌一般于手术当日麻醉后进行，可选择胸骨、双侧髂前上脊、双侧髂后上脊等单部位或多部位，多部位穿剌的阳性检出率高于单部位穿剌。一般抽取5～10ml骨髓液，经Ficoll－hypoque液离心分层，吸取淋巴细胞层洗涤后涂片，针对相应特异性抗原行IHC染色来检测乳腺癌之骨髓微转移。

　　IHC技术用于乳腺癌骨髓微转移的检出率为16％～48％[4～10]。Singhal等[6]对116例切除活检后患者行骨髓穿剌，微转移阳性率为32％；260例未曾切除活检的患者阳性率为39％，二者无统计学差异。Diel等[3]的研究亦证实，手术前和手术后分别检测骨髓微转移的阳性率无显著性差异。说明手术并不增加乳腺癌扩散的机会。另外也证实，乳腺癌即使是早期，亦可能存在肿瘤细胞的血行播散。

　　利用IHC技术检测乳腺癌微转移，虽然其诊断阳性率大大提高，但也有一定的局限性，如某些正常骨髓细胞，淋巴类上皮细胞等可能会出现不同程度的交叉反应，以及肿瘤细胞表面抗原表达的不均一性，均可能影响对转移细胞的正确评判。故实际应用中，应尽量选用两种以上不同的MoAb（针对胞膜和胞质的抗原尤佳），对组化染色阳性细胞进一步观察其形态特征，最后方可诊断骨髓微转移。

　　1.3利用RT－PCR技术检测乳腺癌骨髓微转移

　　RT－PCR是近年来发展起来的生物学技术，为RNA诊断提供了一条简便、灵敏、准确的新途径，其应用越来越广泛。具体方法是，对某一特定基因有表达的组织抽提总RNA，经逆转录反应合成cDNA，然后以该基因的特异性外显子序列为引物进行PCR，扩增的cDNA片断经凝胶电泳分离。因RT－PCR是对某一组织特异基因在mRNA水平的表达检测，故其检测肿瘤隐匿性微小转移灶，无论是敏感性还是特异性方面均优于以往任何方法。与IHC染色相比，即经济又相对简单，且敏感性可增加10～100倍。有报道，RT－PCR方法可在107淋巴细胞中找出3个黑色素瘤细胞[11]；能在106淋巴细胞中找到一个MCF－7细胞[12]；能在107正常细胞中检测到1个成神经细胞瘤细胞[13]；能在106正常骨髓细胞中检测到一个乳腺癌细胞[7]。

　　RT－PCR方法检测骨髓中转移细胞的关键依赖于某种基因的组织特异性表达，即这种基因仅在肿瘤细胞（亦可出现于某些正常组织）表达，而在正常骨髓及血细胞中不表达，如酪氨酸酶（Tyrosinase）是生成黑色素的关键酶，酪氨酸酶基因在黑色素细胞中特异性表达，已用于骨髓和外周血中恶性黑色素瘤细胞的检测[14]。尽管乳腺癌中可有多种基因蛋白的高表达，如多形上皮粘蛋白的核心蛋白（MUCI）、癌胚抗原（CEA）、DF3（一种乳腺癌相关抗原）等，然而，文献报道中应用最多的乳腺癌转移标志物为细胞角蛋白19（CK－19）。实际上，细胞角蛋白并非乳腺癌特异蛋白，其为主要表达于上皮类细胞的一组蛋白质（CK－1～CK－20），以CK－19在正常上皮细胞和上皮性癌细胞的表达最为特异。Brown等[15]在非上皮组织中分别检测了CK－8、CK－18、CK－19的mRNA，结果显示，在广泛的不同种类非上皮组织中均有CK－8和CK－18的表达，而CK－19表达阴性。既然CK－19不在正常造血组织中表达，如果在乳腺癌患者骨髓及外周血中检测出CK－19基因转录物，即可说明有乳腺癌细胞的存在。Datta等[16]将三种人乳腺癌细胞系：T47D、MCF－7、SKBRs分别以不同浓度与正常人骨髓中的有核细胞混合，用RT－PCR方法检测其CK－19mRNA表达，结果可检出106个骨髓有核细胞中的一个癌细胞。证明RT－PCR是敏感、特异、迅速的检测手段。Schoenfeld等[7]将MCF－7细胞与正常骨髓细胞按不同浓度混合，然后分别进行细胞涂片IHC染色和RT－PCR分析，结果IHC能检测出1/105MCF－7细胞，而RT－PCR方法能测出1/106MCF－7细胞，其检测敏感性比IHC提高10倍。Kruger等[17]报道利用RT－PCR技术，骨髓微转移的检出率为41.7％，4例身体其它部位出现转移的乳腺癌患者，其中3例查出骨髓微转移。Schonefeld等[7]分别用IHC和RT－PCR检测了75例无明显远处转移的乳腺癌患者的骨髓和外周血，结果：IHC阳性率22％，RT－PCR为35％。在5例骨扫描发现骨转移的患者中，4例阳性。另4例乳腺癌术后1年以上患者，2例经RT－PCR检测外周血阳性，其中1例经IHC染色发现骨髓中有瘤细胞。作者还报道4例乳腺原位癌患者中的1例（导管原位癌），经IHC和RT－PCR方法均发现骨髓和血液存在微转移。该患者接受了乳腺扩大局部切除，仔细病理检查发现有微浸润（micro－invasion）存在。此例微转移的检出，进一步证实了乳腺癌具有早期播散的特性。

　　最近有报道，先用免疫磁珠法分离癌细胞，再结合RT－PCR（ImmunobeadRT－PCR），以CK－19为标志物，检测乳腺癌外周血中的瘤细胞，结果能由106白细胞中检出1个瘤细胞，其敏感性与单用RT－PCR相仿[18]。

　　RT－PCR联合Southern杂交技术能够进一步提高微转移的检出率。值得注意的是，有报道利用巢式（nested）PCR进行两步扩增，结果在正常淋巴结中亦出现CK－19表达，说明某些正常非上皮细胞亦可能有内源性CK－19mRNA模板的极低水平表达。故一味追求敏感性会导致特异性的降低，而以40轮PCR扩增联合Southern杂交为宜[19]。

　　2　乳腺癌骨髓微小转移灶的临床意义

　　为证实骨髓中检出的癌细胞具有生物学活性，Sharp等将乳腺癌患者骨髓中分离出来的癌细胞于体外培养，结果其可形成克隆，接种裸鼠亦可形成肿瘤。提示临床检测乳腺癌患者骨髓微转移对预测复发、转移可能具有重要意义。Cote等[8]检测49例Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者，骨髓微转移检出率为37％，其中Ⅰ期为23％,Ⅱ期为38％，腋窝淋巴结阴性者为27％，阳性者为41％。平均随访29个月，共有12人（24％）出现复发，骨髓转移最多（6例），其次为肝脏（3例）。骨髓微转移阳性者复发率为33％，而阴性者仅为3％。若与淋巴结转移情况相结合，两者均为阳性的乳腺癌患者，两年复发率为42％；两者均阴性者无复发，差异非常显著。故作者认为，骨髓微转移的检测对乳腺癌的预后判定十分重要，并建议根据骨髓微转移和腋窝淋巴结情况将乳腺癌患者分为高、中、低危险组，并以此来选用相应的辅助治疗。在另一报道中，Mansi等[20]检测350例可手术乳腺癌患者，骨髓微转移阳性率25％，且与肿瘤大小、肿瘤周围血管受侵及腋窝淋巴结转移情况有明显相关性。经6年随访，微转移阳性者，复发率为48％，而阴性者为25％。再次证实骨髓微转移阳性的乳腺癌患者，远处转移率高，总生存期缩短。然而，对此亦有不同观点，最近Molino等[9]报道，对109例Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者于手术前或手术后2～4周行骨髓穿剌检测微转移，结果阳性率31.1％，骨髓微转移与肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、月经状态和雌激素受体情况等因素比较，未发现明显相关性，且对患者无病生存期（DFS）和总生存期（OS）的影响亦无统计学意义。但作者亦认为这种结果可能与随访时间短（3年）有关。

　　骨髓及血液中少量肿瘤细胞的检测，对近年来开展的高危乳腺癌自体骨髓移植（ABMT）或外周血干细胞移植（PBSCT）亦有实用价值，如果这些治疗用细胞中混有肿瘤细胞，无疑将影响其治疗效果。

　　3　小结

　　文献统计表明，骨及骨髓是乳腺癌最易发生转移的部位之一，并常与其它部位的转移伴发。近十余年来，随着检测手段的进步，骨髓微转移的检出率明显提高。尽管各家报道不尽一致，但多数认为其与乳腺癌的预后、复发、转移有明显的相关性，可作为一种有效的预后指标。结合其它因素，确定出具有早期复发、转移危险的高危人群，在其发展为临床转移之前，给予积极辅助治疗。从而渴望降低乳腺癌患者的复发、转移率，提高生存率，延长生存期。同时，又能使部分低危险（微转移阴性）患者免于不必要的化疗造成的痛苦。骨髓微转移检测，尚可作为判定辅助治疗疗效的指标，亦可作为术后患者随访过程中预测复发、转移的依据。

　　诚然，并非骨髓微转移的存在预示将来定会出现复发、转移，尤其是检测中发现的极少数肿瘤细胞（如IHC发现的单个肿瘤细胞），因为转移形成仍受多种因素的影响，但至少表明其具有形成显性转移的倾向。随着积累病例的增多和观察时间的延长，这些微量肿瘤细胞在骨髓中的临床意义将日趋明了。

　　作者单位：北京医科大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院乳腺外科（北京市100036）

　　参考文献

　　1Parker SL,Tong T,Bolden S,et al.Cancer Statistics 1996.CACancer J clin,1996;46:5

　　2Rosen PP,Saigo PE,Braun DW,etal.Predictors of reoccuren ceinstage i(T1N0M0)breast carcinoma.Cancer,1981;193:12

　　3Diel IJ,Kaufmann M,Goerner R,et al.Detection of tumourcell sinbonemarrow of patients with primary breast cancer:a prognostic factor for distant metastasis. j Clin Oncol,1992;10:1534

　　4 Osborne MP,Asina S,Wong GY,et al. Immunofluorescent monoclonal antibody detection of breast carcinoma in bone marrow:sensitivity in a model system. cancer Res,1989;49:2510

　　5 Molino A,Colombatti M,Bonetti F,et al. A comparative analysis of three different techniques for the detection of breast cancer cells in bone marrow. cancer,1991;67:1033

　　6 Singhal H, Cote RJ, Potter C,et al. Bone marrow micrometastases in breast cancer:relationship to local－ regional disease status. (Abstr) Proc ASCO,1994;13:A215

　　7 Schoenfeld A,Kruger KH,Gomm J,et al. The detection of micrometastases in the peripheral blood and bone marrow of patients with breast cancer using immunohistochemical and reverse－ transcriptise polymarise chain reaction for keratin 19. Eur J Cancer,1997;33:854

　　8 Cote RJ, Rosen PP, Lesser ML,et al. Prediction of early relapse in patients with operable breast cancer by detection of occult bone marrow micrometastases. j Clin Oncol,1991;9:1749

　　9 Molino A, Pelosi G, Turazza M,et al. Bone marrow micrometastases in 109 breast cancer patients:correlations with clinical and pathological features and prognosis. Breast Cancer Res Treat,1997;42:23

　　10 Menard S, Squicciarini P, Luini A,et al. Immunodetection of bone marrow in breast carcinoma patients and its correlation with primary tumor prognostic features. Br J Cancer,1994;69:1126

　　11 Wang XN,Heller R,Van Voorhis N,et al. Detection of submicroscopic lymph node metastases with polymerase chain reaction in patients with malignant melanoma. ann Surg,1994;220:768

　　12 Noguchi S,Aihara T,Nakamori S,et al. The detection of breast carcinoma micrometastases in axillary lymph node by means of reverse－ transcriptise polymerase chain reaction. Cancer,1994;74:1595

　　13 Mattano LA, Moss TJ, Emerson SG, et al. Sensitive detection of rare circulating neuroblastoma cells by the reverse－ transcriptise polymerase chain reaction. Cancer Res,1992;52:4701

　　14 Ghossein RA, Coit D, Brennan M, et al. Prognostic significance of peripheral blood and bone marrow tyrosinase messenger RNA in malignant melanoma. Clin cancer Res,1998;4:419

　　15 Brown DC,Purushotham AD,Birnie GD et al. Detection of intraoperative tumor cell dissemination in patients with breast cancer by use of reverse－ transcription and polymerase chain reaction. Surgery,1995;117:96

　　16 Datta YH,Adams PT, Drobyski WR,et al. Sensitive detection of occult breast cancer by the reverse－ transcriptase polymerase chain reaction. J Clin oncol,1994;12:475

　　17 Kruger W, Krzizanowski C, Holweg M,et al. RT－ PCR detection of cytokeratin－19 mRNA in bone marrow and blood of breast cancer patients. J Cancer Res Clin oncol,1996;122:679

　　18 Eaton MC,Hardingham JE, Kotasek D, et al. Immunobead RT－ PCR:a sensitive method for detection of circulating tumor cells. Biotechniques,1997;22:100

　　19 Schoenfeld A, Luqmani Y,Smith D,et al. Detection of breast cancer micrometastases in axillary lymph node by using polymerase chain reaction. cancer Res,1994;54:2986

　　20 Mansi JL,Easton D,Berger U, et al. Bone marrow micrometastases in primary breast cancer:prognostic significance after 6 years' follow－ up. Eur J cancer,1991;27:1552