大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤组织病理及超微结构研究

　　一、材料和方法

　　Wistar雄性大鼠36只，体重270～320g，随机分为缺血1小时再灌注72小时(A1组)，缺血2小时再灌注72小时(A2组)，缺血3小时再灌注72小时(A3组)，缺血4小时再灌注72小时(A4组)，单纯持续缺血4小时(B组)。所有大鼠均按Koizumi方法栓塞右侧大脑中动脉：将单股尼龙线的头端0.5cm热膨胀并打磨后，经颈外动脉，颈总动脉，颈内动脉进入大脑中动脉起始部位，造成栓塞，于栓塞不同时间拔出尼龙线，形成缺血后再灌注。术后大鼠置单笼饲养观察。72小时后断头取脑，以视交叉为中心，向后连续切成1.8mm后冠状脑片，共三片。其中第一片常规HE染色，光镜观察；第二片经处理后H-600电镜观察。第三片常规处理后封片。光镜下观察，凋亡细胞的染色质为蚕豆状浓染，并常可见紫蓝色凋亡小体。以切片平面的面积中凋亡细胞的实际量做计数依据，同时描述凋亡细胞的定位，用HE染色做对比观察。

　　二、结果

　　1.光镜、电镜观察：缺血1小时、2小时再灌注组无中心坏死区，缺血损伤累及广泛皮层及纹状体外侧，半暗带范围扩大，胞核固缩，胞浆消失，广泛性水肿，其间有少量形态完整的神经细胞。

　　缺血3小时再灌注组，已有中心坏死区形成，神经元坏死性变性，胞浆嗜酸，胞核溶解，细胞周边呈扇形空泡改变，周边半暗带范围明显减少，但仍可见到一些形态完整的神经细胞。

　　缺血4小时再灌注组，在坏死区有少量中性粒细胞出现，大量微小动、静脉淤滞，阻塞。

　　持续缺血4小时组，几乎全为坏死区，并有多数中性粒细胞出现，神经无核膜破裂，核浆分界不清，神经网极度水肿，微血管内大量红细胞沉积，纤维蛋白形成，血管内皮细胞表面粗糙收缩，微循环破坏严重。

　　2.程序性细胞死亡的原位检测：缺血1小时再灌注组最多；2小时再灌注组凋亡细胞凋亡细胞少于缺血1小时再灌注组；缺血3小时再灌注组凋亡细胞几乎是缺血1小时再灌注组的1/4，主要分布于中心坏死区周边，并与坏死细胞参杂，坏死细胞在中心坏死区主要存在；缺血4小时再灌注组，凋亡细胞几乎不存在，中心坏死区及中心坏死区周边以坏死细胞为主，中心坏死区与HE染色下发现的坏死范围相当；持续缺血4小时组程序性细胞死亡的原位检测结果与缺血4小时再灌注组检测结果基本近似。

　　三、讨论

　　从我们的前期研究中，缺血3～4小时在灌流至72小时的缺血范围与持续缺血4小时组损伤范围(梗塞体积)基本一致，超过此极限，即使恢复血流供应也不能改善缺血组织预后，并且中心坏死区周围的半暗带范围随时间延长而减少，在局灶脑缺血3小时内行再灌注，可延缓梗塞进展。

　　我们的研究结果提示，缺血性损伤发生不可逆时，在损伤中心区有中性粒细胞出现，循环破坏严重。不同强度的缺血导致细胞凋亡的发生从缺血损伤中心到半暗带，较温和的脑缺血损伤以细胞凋亡为主，剧烈脑缺血损伤以细胞坏死为主，坏死细胞的出现与中性粒细胞的出现相伴随，二者的关系及意义，还有待更深入的研究，可能与细胞因子如：TNF、IL-1、IL-6等激活小胶质细胞、中性粒细胞、巨噬细胞参与继发炎性反应加重脑缺血后再灌流的脑损伤。

　　注：本研究为国家自然基金资助课题