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【摘要】目的评估结直肠癌的切除范围。方法采用单克隆抗体识别的流式细胞分析技术对30例结直肠癌标本的肿瘤组织(T)、癌旁2cm(P2)、癌旁5cm(P5)及远癌切端正常组织(N)进行4点检测，分析各点间DNA指数(DI)、增殖期细胞百分比(SPF)及增殖指数(PI)的差异性。结果T组织异倍体率显著高于P2、P5及N组织，P2与P5组织间异倍体率差异无显著性，而P2、P5组织异倍体率显著高于N组织；T组织的SPF及PI值明显高于P2、P5及N组织，而P2、P5及N各点间检测结果差异无显著性。结论癌旁5cm处组织细胞已出现了潜在的恶变倾向，从而对癌旁5cm作为切除范围的标准已属安全的观点提出了质疑。
To evaluate the safety of distal excision range in colorectal cancer with cellular dynamic method
DONG Ying, ZHU Liwei, WANG Pengzhi, et al.
Department of General Surgery,General Hospital,Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China
【Abstract】 Objective To evaluate the safety of distal excision range in colorectal cancer. Methods The cellular aneuploidy rate of colorectal carcinoma,tissue 2 cm(P2) and 5 cm(P5) away from distal tumor margin and the normal tissue from 30 samples was detected by the flow cytometry. To improve the accuracy and specificity,cells were sorted in advance by monoclonal antibody against K-ras protein. DNA index(DI),S-phase fraction(SPF) and proliferation index(PI) were analyzed. Results The aneuploidy rate in tumors was significantly higher than that in P2,P5 and normal tissues ,meanwhile this rate in P2 and P5 significantly higher than that in normal tissues. No difference of aneuploidy rate was found between P2 and P5 tissues.The SPF and PI increased significantly in tumors compared with P2,P5 and normal tissues， but no differences were found among the last three sites. Conclusions The tendency of canceration has existed in 5 cm away from the tumor margin. The safety of the routine operation that 5 cm is enough for the distal excision should be suspected.
【 Key words】 Cellular dynamics; Colorectal neoplasm; Tissue surrounding tumor
在结直肠癌的多种治疗中，手术切除仍是最有效的方法。近年来，许多学者认为癌旁5cm、甚至2cm以内的切除范围已足够[1-3]，但从随访统计看来，结直肠癌术后5年生存率仍不容乐观。究竟如何选择手术方式，以何种指标作为安全切除范围的依据，是近年来结直肠癌特别是直肠癌研究的一个热点问题[1-3]。本实验通过流式细胞分析技术研究细胞增殖的动态过程，分别对30例结直肠癌标本单克隆抗体识别的肿瘤组织(T)、癌旁2cm(P2)、癌旁5cm(P5)及远癌切端正常组织(N)进行检测，以期从细胞动力学角度去探讨结直肠癌的切除范围。
材料与方法
一、材料
取结直肠癌手术切除标本共30例，经病理诊断证实。标本离体2h内置于－80℃保存备检。
二、方法
取待测组织约150mg，经360目滤网制备单细胞悬液。采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的鼠抗人P21蛋白单克隆抗体及碘化吡啶双重染色法：取细胞悬液(2×106/ml)加100％甲醇4℃固定，洗涤后加1％牛血清白蛋白封闭非特异结合位点，加1∶100抗P21蛋白的单克隆抗体100μl，37℃培养1h，加1∶40FITC标记羊抗鼠IgG抗体100μl，避光4℃下培养30min，行碘化吡淀染色。然后使用FACStar型流式细胞分析仪，取样1×104个细胞进行检测。
三、检测结果分析
采用Cellfit软件计算样本DNA指数(DNA index,DI)、增殖指数(PI)和S期百分数(s-phase fraction,SPF)。分析时，在FL1为纵坐标的点图上设门，以分选出高FITC荧光强度的P21蛋白阳性细胞进行检测。
1.DI计算方法：DI=待检细胞FL2 G0/G1峰荧光道数/正常人二倍体细胞FL2 G0/G1峰荧光道数
经用正常人淋巴细胞DNA含量校正，二倍体细胞DI=0．88～1．12，在此范围之外为异倍体细胞。
2.PI计算方法：PI=(S＋G2＋M)×100
S为细胞周期中合成期细胞百分比，G2为分裂前期百分比，M为分裂期细胞百分比。
3.SPF计算方法：SPF=S×100
四、统计学处理
本实验计量资料数据采用方差分析处理；计数资料数据采用四格表的确切概率法分析处理。
结果
一、各组细胞异倍体率
根据倍体性指标将全部患者分为整倍体(包括二倍体与近二倍体)和异倍体两组(表1)。经两两之间χ2检验，T组织细胞异倍体率显著高于P2、P5及N组织；P2与P5组织细胞间异倍体表达率差异无显著性；在以N组织为参照，设定其异倍体检出率为0的前提下，P2、P5组织异倍体率显著高于N组织(表1)。
表1 各组标本细胞倍体性分析(例)
标本 例数 异倍体 检出率（％）
T 30 20 66.67
P2 29 11 37.93
P5 29 11 37.93
N 30 0 0
注：χ2检验，T与P2、T与P5相比，P＜0．05；T与N相比，P＜0．01；P2与N相比，P＜0．01；P5与N相比，P＜0．01
二、各组细胞增殖活性的评估
本组30例标本各点的SPF及PI值方差分析及q检验结果表明，肿瘤组织细胞的SPF及PI值远高于P2、P5及N组织，而P2、P5及N各点间检测结果差异无显著性意义(P＞0．05)(表2)。
表2 各组标本SPF及PI值检测(±s)
标本 例数 SPF F P值 PI F P值
T 30 33．76±8．72 46．65±10．98
P2 29 26．75±7．20 9.88 0.00 37．31±11．71 0.00
P5 29 25．49±6．93 0 36．58±11．46 8.28 0
N 30 22．86±7．44 31．36±10．69
注：不同位点SPF值两两比较，P检验，T与P2、T与P5、T与N相比，P＜0．01； P2与 P5、 P2与 N、 P5与 N相 比 ， P＞0．05
不同位点PI值两两比较，P检验，T与P2、T与P5、T与N相比，P＜0．01； P2与 P5、 P2与 N相 比 ， P＞0．05
讨论
1951年Dukes及Bussey等提出直肠癌远切端必须距肿瘤边缘5cm才能保证肿瘤的彻底切除，此后，Goligher又提出切除2．5～3cm已足够的论点，目前一些学者[1-3]认为，癌远端切除5cm是不必要的，多数情况下切除2cm已能满足治疗需要，而传统的切除5cm以上才安全的观点将导致许多低度恶性的肿瘤患者不必要地丧失其肛门功能。上述种种观点的形成往往是基于边缘无癌细胞这一组织学检查的发现，但有无癌细胞只说明普通光镜下组织细胞由量变到质变这一发展过程的结果，而不能体现其动态过程。肿瘤细胞从病理形态上来看，出现核异型，核浆比例增大，染色体数目偏离正常的二倍体结构，形态不规则等表现。但是这种病理学上的判断也存在着主观因素，使得检出的结果出现偏差。因此从肿瘤细胞动力学上去探讨手术切除的安全距离，对正确地掌握手术治疗范围具有重要的参考价值。
癌细胞的分裂增生处于一种非正常状态，肿瘤细胞无限分裂增殖的实质是DNA不断复制的结果，因此常会出现DNA倍体性及增殖活性的改变。许多资料表明，DNA异倍体能反映肿瘤的生物学特性，是恶性肿瘤的特征性改变[4]，其与肿瘤恶性程度及预后直接相关[5]。近期细胞遗传学与DNA异倍体相关性研究表明[6-8]，DNA异倍体的细胞往往伴有遗传学的异常改变，提示DNA异倍体可能是细胞染色体发生了某些不稳定性改变(如癌基因的突变)的结果。一旦这些不稳定性改变积累到一定程度，出现优势细胞克隆时，癌的发生将是不可避免的。因此，在组织学未见到癌变征象时，DNA异倍体可作为监视细胞癌变的一个有益的补充，将能更好地预示细胞的恶性转化，有助于发现组织学难以确定的“生物”学早期癌组织。目前文献中对流式细胞DNA异倍体的判断标准为[9]：(1)DNA组直方图上出现与二倍体G0/G1峰分离的另一个或多个异倍体G0/G1峰；或(和)(2)异倍体DNA指数至少从1．0偏差10％。检测时的内参标准最好是肿瘤相对应的正常组织细胞，同个体来源更好。本实验以30例标本的正常组织作为内参标准，各点检测值分别与其相比所得比值超出DI值者为异倍体。结果显示肿瘤的异倍体率远较P2、P5点为高，P2、P5点异倍体率也远高于正常组织。肿瘤的发生表现为细胞的无限增殖，因此在癌组织中处于DNA合成期细胞的百分比远较正常组织为高，通过SPF与PI指标即能从另一个侧面较好地反映细胞增殖活性，借以评估细胞的增殖状态。本实验结果显示，T组织的增殖活性远较P2、P5及N组织为高。
综上所述，我们认为：T组织异倍体率、SPF及PI值显著高于P2、P5及N组织，结直肠癌处于DNA合成期细胞明显增多；P2、P5组织异倍体率显著高于N组织，提示距癌旁5cm处细胞已处于活跃增殖状态，核酸代谢已出现异常，异倍体率明显增加，细胞已出现潜在的恶变倾向，因此，切端距肿瘤边缘5cm已属安全的传统观点应受到质疑。
参 考 文 献
1.Mcdemott FT,Hughes ESR,Pin1 E. Local recurrence after potentially curative resection for rectal cancer in a series of 1008 patients. Br J Surg,1985,72:34-37.
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3.Williams NS,Dixon MF,Johnston D. Reappraisal of the 5 centimetre rule of distal excision for carcinoma of the rectum study of distal intramural spread and of patient s survival. Br J Surg,1983,70:150-154.
4.佘金生.流式细胞DNA异倍体与大肠癌等病变.国外医学内科学分册，1995，22：277－279.
5.王杉.结直肠癌P21ras的计量分析与预后.中华外科杂志，1994，32：480-482.
6.Burmer GC,Rabinovich PS, Haggitt RC,et al.Neoplastic progression in ulcerative colitis:histology,DNA content and loss of A p53 allele. Gastroenterology,1992,103:1602-1610.
7.Dressler LG,Duncan MH,Varsa EE,et al.DNA content measurement can be obtained using archival material for DNA flow cytometry.A comparison with cytogenetic analysis in 56 pediatric solid tumors. Cancer,1993,72,2033-2041.
8.Brentnall TA,Gispin DA,Rabinovitchi PS ,et al.Mutations in the P53 gene:an early marker of neoplastic progression in ulcerative colitis. Gastroenterology,1994,107:369-378.
9.Shankey TV,Rabinovitch PS,Bagwell B,et al.Guidelines for implementation of clinical DNA cytometry.International Society for Analytical Cytology. Cytometry,1993,14,472-477.