周围神经端侧吻合后乙酰胆碱转移酶变化

 

　　【摘要】　目的　建立一种测定乙酰胆碱转移酶（ChAT）的方法，以定量研究神经端端吻合与端侧吻合后神经再生能力。方法：实验显露大白鼠胫神经及腓神经，并在腓神经分支处以远0.5 cm处切断。端侧吻合组在胫神经上行外膜开窗，造成5mm×5mm外膜缺损，然后将腓神经在此处与胫神经作端侧吻合。端端吻合组使腓神经切断后直接作端端吻合。术后1～3个月分别测定切断端以远ChAT活性，并在3组之间作比较，即（1）端端吻合组，（2）端侧吻合组，（3）非吻合组及正常对照组。　结果　端侧吻合3个月后ChAT活性是正常对照组的一半。组织学显示端侧吻合与端端吻合组均显示有大量有髓纤维存在。　结论　这些结果提示端侧吻合后具有ChAT活性证实神经端侧吻有可能为临床治疗神经撕脱伤及大段缺损提供一条途径。

　　Surgically intervened collateral sprouting of peripheral nerve: The Change of Cholineacetyl-transferase

CAO Xuecheng, CAI Jinfang

　　Department of Orthopedic Surgery，Jinan Military General Hospital，Jinan，Shandong. 250031

　　【Abstract】 Objective　To establish an assay of the choline-acetyl-transferase （ChAT） activity to investigate the regeneration of injured peripheral nerve，repaired end-to-end or end-to-side.Method　Murine sciatic and peroneal nerves were exposed and the peroneal nerve was transected at the site of 0.5cm from its ramification.For the end-to-side neurorrhaphy，epineurotomy producing a 5×5 mm window was carried out on the tibial nerve just above the level of gastrocnemius muscle ramification.The peroneal nerve stump was then anastomosed end-to-side to the tibial nerve window.For the end-to-end enurorrhaphy，the peroneal stump was directly anastomosed end-to-end.The ChAT activity was measured at the site distal to the peroneal stump at 1 to 3 months postoperatively，and the results were compared among the three groups，i.e.1） end-to-end neurorrhaphy group，2） end-to-side neurorrhaphy group，3）unrepaired group，and normal controls.Results　The ChAT activity of end-to-side neurorrhaphy yielded approximately two third of the value of end-to-end neurorrhaphy and more than half of the value of normal controls at 3 months postoperatively.The histological section of end-to-side and end-to-end anastomosed peroneal nerve demonstrated the large numbers of myelinated axons and Schwann cells at the third month.Conclusion　All of these results indicate that end-to-side neurorrhaphy is comparable to that of well-performed end-to-end neurorrhaphy and therefore，this provides an option of surgical treatment for avulsion nerve injury and massive nerve defect.

　　【Key words】 Peripheral nerve Transplantation　Cholineacetyl-transferase Peroneal nerve

　　在正常情况下，当某一区域失神经支配时，邻近正常的神经能终端发芽使其得以支配,这称为“失支配发芽”［1，2］。有趣的是，通过外科操作如端侧吻合可使周围神经在神经干的特定部位侧支发芽，我们称之为外科干预的侧支发芽（Surgically Intervened Collateral Sprouting）.以前的类似研究致力于证明该技术的临床可行性，其检测方法仅局限于组织学及受累肌肉的收缩能力测定［3，4］。然而，端侧吻合后失支配神经的再神经化水平与端端吻合相比有无优越性并未阐明。本研究拟用定量测定乙酰胆碱转移酶活性及组织学方法回答这一问题。

　　材料与方法

　　一、外科干预的神经侧支发芽的模型

　　选用7周SD大白鼠，体重150～200 g。乙醚吸入麻醉后以0.5％苯巴比妥钠作腹腔内注射麻醉，按每公斤体重1ml注射。无菌技术显露右侧坐骨神经及腓神经，将腓神经在其分支以远0.5　cm处切断，然后随机分为3组：

　　第1组，大白鼠12只，在胫神经的腓肠肌支分支以上作外膜开窗0.5mm×0.5mm，将腓神经远端以11-0显微缝线端侧吻合于胫神经开窗处，腓神经近端游离后牵向近端并缝合于附近肌肉上。

　　第2组，大白鼠12只，离断后的腓神经作端端外膜缝合。

　　第3组，大白鼠6只，远端牵向远侧放置不作修复作阴性对照组。

　　所有动物术后均自由进食进水，无动物死亡。另有一组动物不作任何手术，采取腓神经测定ChAT活性作阳性对照。

　　二、实验大白鼠腓神经乙酰胆碱转移酶的活性测定

　　第1组及第2组分别于术后1、2及3个月行第二次手术。显露右侧腓神经，吻合口以远0.5cm处取1mm长神经片段。第3组仅在术后第3个月取腓神经远端1mm长神经片段。再从正常鼠腓神经取7段神经片段，分别测定乙酰胆碱转移酶活性［5-7］。培育时间为15分钟。结果表示为CPM（每分钟计数次数）。第1、2组之间差别以t检验作统计学分析。

　　三、组织学检查

　　术后3个月分别采取第1及第2组吻合部位以远神经标本以及第3组腓神经远断端的神经片段作组织学检查，以证明有无有髓神经纤维的存在。所有标本均以10％磷酸缓冲的福尔马林溶液固定过夜，石腊包埋，横行切片2 μm厚作标准Kluver-barrera染色。最后以光学显微镜观察。

　　结果

　　一、神经再生及侧支发芽时的ChAT活性

　　正常腓神经ChAT活性为（4060±1712）cpm（±s），而失神经支配3个月后（第3组）腓神经ChAT活性为（73±21）cmp。

　　第1组（端侧吻合组）与第2组（端端吻合组）之ChAT活性均较高。在术后第1个月即可测得较高的ChAT活性，第2个月达到高峰，此后进入一个平台，变化不大。第1组与第2组在第2及第3个月时ChAT活性之间差异有显著性（P＜0.05）。第2组在第2个月后ChAT活性达到正常的80％以上，而第1组ChAT活性在第2个月时是正常的70％，第3个月时是正常的55％（图1）。

　　讨论

　　外科干预的神经侧支发芽以前仅有少数研究［3，4］。在本动物模型中，腓神经的再神经化纤维被认为来自胫神经，我们通过阴性对照的方法提供了进一步证据，即未作端侧吻合的腓神经未出现再神经化；在术后第3个月ChAT活性低到可以忽略不计的程度，组织学检查也未见有髓神经纤维的长入。然而第1组ChAT活性却较高，组织学发现有大量的有髓纤维存在。这证明，腓神经端侧吻合于胫神经是侧支发芽使失支配的神经再神经化的必要条件。我们推测，通过这种外科手术，变性神经的雪旺氏细胞增生及向供体神经的浸润对侧支发芽的发生起重要作用。

　　侧支发芽水平随时间的变化的研究对这一特殊现象的理解也有重要意义。在第1组与第2组，术后1个月即可测到中等的ChAT活性，在第2个月时，第1组ChAT活性为正常的55％，第2组ChAT活性为正常的80％，此后，变化不大，在某种程度上还有所下降。原因仍未明了。据研究，当神经再生时，再生纤维存在着错位现象［8］。经历一段成熟过程后，多余的纤维或无用的纤维将会被修剪或退缩，只有那些已建立起功能联系的纤维才存活下来，所以我们推测，神经侧支发芽同神经再生一样也存在这种现象。

　　本实验的另一个目的是试图回答侧支发芽能使失支配神经再神经化的能力。因为对一个外科医生来说，最想知道其是否在临床上具有可行性。为了达到这一目的，第一步应是找一个能与其比较的标准。在本文中，我们比较端端与端侧吻合后再神经化的能力。在这两种情况下，都以腓神经作实验模型，端端吻合后的再生以及端侧吻合后的侧支发芽都以同一神经作基准，因此具有可比性。

　　第1、2组之ChAT活性之比在术后不同时间为76％～80％，是正常的55％～70％。这即是说，端侧吻合后侧支发芽再神经化的能力是端端吻合再生后神经化能力的2／3，是正常神经的一半以上。

　　用端侧吻合使失支配神经再支配的方法已见于临床报道［9］。我们认为该方法为神经缺损和撕脱伤的修复提供了一种可能的途径。我们的实验研究也支持其应用的可能。但如何进一步促进侧支发芽使神经再支配的能力仍是今后研究的课题。

　　参考文献

　　1　Kinnman E， Aldskogius H.Collateral sprouting of sensory axons in the glabrous skin of the hindpaw after chronic sciatic nerve lesion in adult and neonatal rats：a morphological study.Brain Res，1986，377：73-82.

　　2　Robinson P.Resession of sensory loss from the midline following trigeminal sensory root section：collateral sprouting from the normal side.Brain Res，1983，253：177-180.

　　3　Viterbo F，Trindade J，Hoshino K，et al.End-to-side neurorrhaphy with removal of the epineurial sheath：an experimental study in rats.Plast Reconstr Surg，1994，94：1038-1046.

　　4　Lunborg G，Zhao Q，Kanje M, et al.Can sensory and motor collateral sprouting be induded from intact peripheral nerve by end-to-side anastomosis.J Hand Surg，1994，19 B：277-282.

　　5　Ohgushi H，Tamai S，Masuda S，et al.Choline acetyltrans ferase activity in the differentiation between motor and sensory funiculi in peripheral nerve.Sekegeka （Japanese），1983，34：2034-2039.

　　6　Fonnum F.A radiochemical method for the estimation of choline acetyltransferase.Biochem J.1976, 100：479-484.

　　7　Yajima H，Kawanish K，Ohgushi H，et al.Experimental study on choline acetyltransferase activity measurement for brachial plexus injury.Microsurg.1995，16：679-683.

　　8　Luo ZJ，Lu SB.Selective reinnervation of regenerating mixed fibers across a silicon tube gap.J Hand Surg，1996，21 B：660-663.

　　9　Viterbo F，Franciosi L，Palhares A.Nerve grafting and end-to-side neurorrhaphies connecting the phrenic nerve to the brachial plexus.Plast Reconstr Surg，1995，96：494-495.