许旺细胞源神经营养蛋白受体的初步定位

　　【摘要】　目的　探讨脊髓前角运动神经元是否存在许旺细胞源神经营养蛋白的受体。　方法　采用放射性配体结合分析法，对许旺细胞源神经营养蛋白进行125I标记，以125I标记的许旺细胞源神经营养蛋白（125I-SCDNTP）为配体，与SD胚鼠的脊髓前角运动神经元进行受体结合分析。　结果　（1）125I-SCDNTP特异结合最大结合容量为（6.1±0.48）fmol／106cells，平衡解离常数为（3.82±0.60）pmol／L；（2）动力学分析显示k1＝（8.03±0.32）×108mol－1.L·min－1，k－1＝（2.62±0.82）×10－3min－1；（3）特异性分析表明许旺细胞源神经营养蛋白与运动神经元的结合具有高度特异性。　结论　在SD胚鼠的脊髓前角运动神元上存在着高亲和力许旺细胞源神经营养蛋白的受体。

　　Radioreceptor assay of Schwann-cell derived neurotrophic protein

　　LU Xiaolin，ZHU Jiakai， LIU Changzhen，et al.

　　Department of Microsurgery，First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Sciences，Guangzhou 510080

　　【Abstract】　Objective　To identify the presence of schwann cell derived neurotrophic protein（SCDNTP）receptor in motoneurons.Methods　SCDNTP was labeled with 125I using chloramine-T method and isolated by sephadex G75 column chromatography.The receptor assay between 125I-SCDNTPand embryonic rat spinal motoneurons was carried out with 125I-SCDNTP as a radioligand.Results　The right condititon of binding was incubation at 25℃，PH 7.4，for 20 min in 1.2×105 cells/ tube.Scatchard plotting shown that there was a high-affinity binding.Equilibrium dissociation constant（Kd）and maximal binding capacity（Bmax）were（3.82±0.60）pmol／L and（6.1±0.48）fmol／106 cells respectvely.The kinetics of 125I-SCDNTP binding were characterized by the association rate constant［k1＝（8.03±0.32）×108 mol－1.L·min－1］and dissociation rate constant［k－1＝（2.62±0.82）×10－3 min－1］.Specificity studies revealed this binding were highly specific.Conclusion　These results demonstrate the presence of SCDNTP receptor in embryonic rat spinal motoneurons.

　　【Key words】 Schwann cells Neurotrophic factors Receptor

　　许旺细胞源神经营养蛋白（Schwann-cell　derived　neurotrophic　protein，SCDNTP）是从许旺细胞中提取的一种神经营养蛋白，分子量为54kD，尤其对运动神经元有较强的营养支持和促进其损伤后修复作用［1］。但SCDNTP的作用机制尚不清楚。国内外报道的一些神经营养蛋白是通过激活相应的受体起作用［2］。SCDNTP是否也有受体存在须持证实。本实验用125I标记SCDNTP，采用放射配体结合分析来研究运动神经元是否存在SCDNTP受体。

　　材料与方法

　　一、主要试剂与仪器

　　SCDNTP本实验室自制。Na125I，无载体，8.71GBq／ml，中国原子能科学研究院同位素研究所制品。2.5sNGF、bFGF、BDNF、NT-3为Cigma产品，氯胺T，分析纯。Tris-磷酸缓冲液，0.05mol／L，PH7.4。Sephadex-G75，Pharmacia公司产品。Sephadex　G75凝胶柱(柱长15cm，直径1cm）。XH-6010γ放射免疫计数器。

　　二、运动神经元分离与纯化

　　14～15天胚龄SD大鼠16只，取脊髓腹侧半，按Victoria法［3］酶消化、密度梯度离心分离运动神经元，用胆碱乙酰基转移酶单克隆抗体免疫组化鉴定运动神经元并进行细胞计数。

　　三、125I-SCDNTP制备

　　采用氯胺T氧化法：取Na125I　1.85×107Bq／10μl，加SCDNTP　20μg／10μl，氯胺T20μg／250　μl冰水浴下搅拌1分钟，加偏重亚硫酸钠100μg／250μl，1％碘化钾100　μl终止反应。立即将反应混合物上Sephadex　G75凝胶柱层析（15×1cm）分离结合和未结合的125I，用Tris-磷酸缓冲液淋洗，流速1ml／min，以每管0.5　ml分布收集淋洗流出液并测量其放射性，收集第一放射峰并分装，于－20℃贮存。根据淋洗曲线计算标记率和比活度(直接法)，用纸层析法测定标记物的放化纯度。

　　四、放射性配基结合分析

　　(一)温度和时间对配体-细胞结合的影响

　　Eppendorf管中加运动神经元悬液100μl（1.2×105cells），125I-SCDNTP50μl（3×104计数／分钟)，非特异结合管中另加入SCDNTP50μl（54nmol／L）。分别于4℃、25℃、37℃条件下反应5、10、20、30、40、60、90分钟（pH均为7.4），每管加4℃的缓冲液稀释混匀，4℃、4 000r／min离心10分钟，吸去上清液，测沉淀的放射性。计算特异性结合，根据其与时间和温度的关系，从中筛选最佳的反应温度和时间。

　　(二)饱和结合实验

　　应用放射配体结合法，设对应的总结合管（TB）和非特异结合管（NSB），共9组，每管设6个复管，加运动神经元悬液100μl（1.2×106　cell／ml），Tris-磷酸缓冲液300μl及已倍比稀释成9个浓度的125I-SCDNTP50μl，终浓度（0.8～1.2）pmol／L，总体积450μl。非特异结合管（NSB）另预加1000倍于标记SCDNTP的非标记SCDNTP。测定各管的放射性，计算特异性结合（SB），SB＝TB-NSB。作饱和曲线并进行Scatchard作图，计算平衡解离常数（Kd）与最大结合容量（Bmax）值。

　　(三)动力学分析

　　运动细胞1.2×105个，125I-SCDNTP终浓度为8pmol／L，总反应容量为450μl，在25℃反应不同时间后测125I-SCDNTP特异结合量，计算结合常数（K1）；另一组在上述反应30分钟后加非标记的SCDNTP终浓度为4nmol／L，再在不同时间测定125I-SCDNTP特异结合量，并计算解离常数（K－1）。

　　(四)125I-SCDNTP结合特异性分析

　　分别用7种浓度(每浓度设6个复管)的SCDNTP、2.5sNGF、bFGF、BDNF、NT-3来观察对125I-SCDNTP特异性结合的取代率IC50，比较125I-SCDNTP与运动神经元结合的特异性。

　　结果

　　一、运动神经元的分离

　　免疫组化鉴定运动神经元占细胞总数86％，细胞计数后调整细胞浓度至1.2×106cell／ml备用。

　　二、125I-SCDNTP的制备

　　标记物标记率为56％，比放射性5.18×105Bq／μg，放化纯度为98％。

　　三、放射性配体结合分析

　　（一）pH7.4时，从4℃、25℃、37℃条件下体外的配体结合的时间曲线(图1)来看，温度和时间对配体结合反应有明显的影响。37℃条件下结合反应虽快，但解离也快；4℃时反应达平衡的时间较长；而最佳的反应温度为25℃，反应达平衡的时间为30分钟，并且在20分钟内保持稳定。在此条件下，既能保证反应能迅速达到平衡，又能有一个比较长的平衡稳定期。

　　(二)饱和结合实验

　　运动神经元与125I-SCDNTP结合饱和曲线呈饱和双曲线型，Scatchard［4］分析结果得Kd为（3.82±0.60）pmol／L，Bmax为（6.1±0.48）fmol／106cells。

　　(三)125I-SCDNTP与运动神经元结合与解离的动力学分析结果：结合过程在5～20分钟显著增加，至30分钟达饱和状态。这时加入非标记的SCDNTP即开始了解离过程。根据假一级和一级速率常数法［5］求得K1为（8.03±0.32）×108mol－1.L·min－1，K－1为（2.62±0.82）×10－3min－1。据此得Kd＝K1／K－1＝（3.1±0.46）pmol／L，与Scatchard分析结果相似。

　　(四)SCDNTP对125I-SCDNTP特异结合的取代率IC50为（2.1±0.18）nmol／L，bFGF、BDNF、2.5sNGF、NT-3的IC50均大于105nmol／L，结果表明125I-SCDNTP与运动神经元结合具有高度的特异性［5］。

　　讨论

　　一、作为受体分析用的标记配体应具有高度的放化纯度、合适的比放射性及良好的生物活性，这一点非常重要。碘标记简单易行，一般认为平均一个蛋白质分子结合一个以下碘原子不影响它的生物活性［6］。本实验中制备的125I-SCDNTP每个分子平均结合0.35个碘原子，不会影响它的生物活性，这点在随后的受体分析中得到证实。

　　二、许旺细胞源神经营养蛋白受体分析表明在SD胚鼠的脊髓前角运动神经元中存在许旺细胞源神经营养蛋白碘化标记物的特异结合部位，它具有以下特点：(1)结合曲线呈饱和双曲线；(2)低结合容量。Bmax为（6.1±0.48）fmol／106cells；（3）高亲和力。饱和分析Kd为（3.82±0.60）pmol／L，动力学分析Kd为（3.1±0.46）pmol／L；（4）动力学分析表明结合具有饱和性和可逆性；(5)特异性分析显示该结合部位与其配体的结合具有高度的特异性。以上几 点可以满足受体存在的基本条件，加之Scatchard分析的回归线呈一直线，提示运动神经元中存在单一的许旺细胞源神经营养蛋白的受体［4］。但该受体在体内及细胞内的具体分布有待进一步研究。

　　三、近年来有关神经营养因子受体的报道很多，其中很多种如NGF、NT3／4等神经营养因子的受体都属一类即Trk受体家族［2］。而本实验中125I-SCDNTP的特异性结合不能被2.5sNGF、bFGF、GDNF、NT-3取代，提示许旺细胞源神经营养蛋白的受体与这些神经营养因子的受体不同，也不属Trk受体家族。

　　本课题受国家自然科学基金资助

　　参考文献

　　1　陈强，朱家恺，顾熊飞.雪旺氏细胞源神经营养蛋白的进一步纯化及活性研究.中华显微外科杂志，1998，21（增刊）：29-31.

　　2　陈谦，汪家政，范明.神经营养因子在神经损伤中的作用机制.神经解剖学杂志，1998，14：278-282.

　　3　Victoria L.Turgeon D，Elizabeth D，et al.Thrombin perturbs neurite outgrowth and induces apoptotic cell death in chick spinal motoneuron cultures through caspase avtivation.Neuroscience，1998，18：6882-6891.

　　4　曹泽毅主编.激素受体及其临床应用.第1版.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993，99-118.

　　5　吕宝璋，田英编著.受体学概念.第1版.北京：科学出版社，1991，36-38.

　　6　雷幼导，张敏.受体放射分析中标记配体的评价.标记免疫分析与临床，1998，5：28-30.