出诊医院: 上海市第六人民医院 血液内科
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骨髓增殖性肿瘤中的CALR突变

    发布时间:2015-12-21    编辑:常春康
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  2005年随着费城染色体阴性(PH-)骨髓增生性肿瘤(MPNs)患者中发现JAK2V617F突变,MPNs诊断已取得重要进展,在其发病机制涉及JAK / STAT通路,并已作为一种新的靶向治疗。尽管如此,大约三分之一非JAK2或MPL突变的原发性血小板(ET)以及原发性骨髓纤维化(PMF)的患者是否存在突变当时仍然是未知的。直到2013年底,两项使用全外显子测序方法的研究确定了编码钙网蛋白(CALR)的重现性基因突变。这种突变出现在大多数非JAK2或MPL突变的ET和PMF患者中,但真性红细胞增多症(PV)患者不出现。CALR基因(最后一个外显子编码蛋白质钙网蛋白的C-末端氨基酸)的外显子9的体细胞52-bp缺失(1型突变)和重现性5-bp的插入(2型突变)被检测到,并总是发现其产生移码突变。所有检测到的突变体钙网蛋白共享在C-终端的新的氨基酸序列。CALR突变在疾病的克隆早期获取,并且导致JAK / STAT激活。CALR突变是MPNs患者中继JAK2V617F突变后第二个最常见的基因突变,他们的检测已显著改善了ET和PMF的诊断方法。本文着重讨论CALR突变的特点以及其在本病的诊断、临床和发病机制中的影响。
  经典的费城染色体阴性(PH-)骨髓增殖性肿瘤(MPNs)包括真性红细胞增多症(PV),原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)。在2005年,JAK2V617F突变的发现,JAK / STAT通路激活引起的MPNs取得了重大的进步JAK2V617F突变出现在于95%的PV,50%的ET和60%的PMF病人。随后发现其他两个突变(JAK2外显子12和血小板生成素受体的基因突变,骨髓增生性白血病,MPL)也直接影响这一途径。在JAK2外显子12突变存在于2%的PV患者;对MPL突变存在于非JAK2突变的5%的ET和10%的PMF病人。观察MPNs的体细胞突变,其它基因如TET2,ASXL1,DNMT3A和EZH2被发现在JAK2和MPL突变的患者中,且其出现是非特异的。直到最近,在大约三分之一的非JAK2或MPL突变的ET和PMF,使动突变并没有得到认可。2013年,由Klampfl和Nangalia研究确定在非JAK2或MPL突变患者中出现重现性编码钙网蛋白(CALR)的基因突变,及其在MPNs发展中的作用。进一步的研究观察CALR突变在MPNs发病中的作用,并且已经报道了和这些突变的临床相关性的作用。
  CALR突变的发现
  Klampfl等用外显子测序检测6例JAK2和MPL阴性的PMF外周血粒细胞的DNA(肿瘤样品)和匹配的CD3+ T淋巴细胞的DNA(对照样品)。每名患者的2-12的体细胞突变被发现,只有CALR(位于染色体19p13.2,含有9个外显子,编码钙网蛋白)基因是重现性的。两例有体细胞缺失,4例患者有重现性的5-bp的插入CALR的外显子9中(编码蛋白质的C末端氨基酸)。
  PCR检测896例MPNs患者的CALR外显子9的插入和缺失突变。PV患者均未发现CALR突变。25%的ET和35%的PMF患者检测到CALR突变。所有CALR突变的患者均为非JAK2和MPL突变(CALR突变与JAK2和MPL突变是相互排斥的)。
  少于10%ET或PMF的患者JAK2、MPL和CALR突变均为阴性。已经报道了一些研究分析MPN的CALR突变,10%-23%ET患者报告三阴性(JAK2,MPL和CALR突变阴性)。
  Nangalia等用外显子组测序的方法检测了151例MPN样本。在31例非JAK2或MPL突变的ET或PMF中26例CALR体细胞突变阳性。
  JAK2V617F和CALR外显子9的突变被认为是相互排斥的。然而已经报道了3例(2例ET和1例PMF)的双突变(JAK2V617F和CALR突变)。双突变的真实频率,致病性和临床意义尚不清楚。
  其他骨髓疾病患者(急性髓性白血病、慢性髓性白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性粒单核细胞白血病、难治性贫血伴环形铁粒幼细胞增多伴有明显血小板增多(RARS-T))分别检测CALR外显子9,3名RARS-T患者筛选有CALR突变。8%的MDS患者CALR突变性。524的健康志愿者中1例存在突变。
  检测发现36种类型导致移码来替代阅读框的体细胞突变CALR(插入和删除)。1型(52 bp缺失)和2型(5-bp的插入)CALR突变分别占53.0%和31.7%。1型突变在PMF比ET更频繁。其它突变类型观察到的频率均低得多。
  钙网蛋白
  钙网蛋白是多功能的蛋白质。在内质网中,蛋白质可确保新合成的糖蛋白的适当折叠和调节钙动态平衡。钙网蛋白也存在于细胞内、细胞表面和胞外区室,在那里它已经牵涉到许多生物过程,包括增殖、凋亡和免疫原性细胞死亡。
  钙网蛋白有三个主要的结构和功能结构域:N-末端凝集素结合结构域,一个富含脯氨酸P域,并包含多个钙结合位点的C末端的酸性结构域。钙网蛋白包含内质网在C-末端滞留基序(KDEL基序)。该KDEL基序出现在一些内质网的蛋白质,使这些蛋白质从高尔基体回到内质网。
  伴有C末端改变的CALR蛋白突变体
  所有检测到的CALR蛋白突变体共享一个在C-末端新的氨基酸序列。非突变CALR C-末端主要是带负电荷的,而CALR突变C-末端包含许多带正电荷的氨基酸。1型突变消除几乎所有的带负电荷的氨基酸,而2型突变保留约一半的带负电荷的氨基酸。由于钙网蛋白的负电荷的C-末端结构域是低亲和性、高容量、钙离子结合结构域,钙离子结合性的蛋白突变体的功能可能被削弱。此外,KDEL基序在C-末端是失去了在所有的突变体。因此,突变型钙网蛋白可具有改变的亚细胞定位。
  调查是否在CALR突变患者的克隆细胞史早期或晚期,分析MPN患者获得的造血前体细胞克隆,结果发现,CALR突变主要出现在早期克隆。
  CALR突变在MPN中的致病作用
  非突变和1型突变CALR分别转入IL-3依赖性鼠细胞系。表达1型CALR突变细胞显示增长,它不依赖于IL-3且对IL-3敏感。表达非CALR突变或1型突变CALR的细胞对JAK2激酶抑制剂显示类似的敏感性,这表明依赖IL-3生长的CALR突变细胞依赖于JAK2或JAK家族激酶。为了证实该假说,检测存在或不存在IL-3的对照和CALR转染细胞系中的STAT5磷酸化。在不存在IL-3的和在低浓度IL-3的1型突变CALR细胞,但不是在非突变CALR细胞中检测STAT5的磷酸化增加。这些发现支持的假设激活1型CALR突变的JAK / STAT信号。
  家族性MPN
  尽管大多数的MPN都是散发的,家族性MPNs(至少2名成员患有MPN)有很好的描述。家族成员MPN可能有获得性的体细胞突变。相信患者的家族MPN继承“易感性”源于MPN的体细胞突变。一项研究发现21例家族性MPNs中两名成员有CALR突变,表明这些基因突变也可发生在家族性病例。
  MPN患者CALR突变的临床相关性
  CALR突变与低龄、男性ET患者和低龄化的PMF 患者相关。
  血细胞计数
  ET的患者中,诊断时那些具有CALR突变患者比JAK2突变患者有较低的血红蛋白水平、较低的白血细胞(WBC)计数和较高的血小板计数。JAK2V617F突变患者比CALR突变患者与有较低血清促红细胞生成素。
  PMF患者中,诊断时那些具有CALR突变患者比突变JAK2有较低的WBC和更高的血小板计数。单因素分析254例PMF,CALR突变与较高的血小板计数有关(P<0.0001),CALR突变患者贫血和白细胞增多相对较轻。
  血栓风险
  ET患者中,有CALR突变者血栓发生率低于JAK2 突变。144例内脏静脉血栓形成(SVT)风险的比较队列研究中,JAK2V617F突变者的发生率为18.8 %;CALR外显子9的突变患者均未发生。这一发现支持CALR突变患者与JAK2突变的风险相比血栓的发生较低。
  红细胞增多转化
  15年的随访发现,红细胞增多患者没有CALR突变,JAK2突变ET累积风险是29%。
  骨髓纤维化转化
  根据体细胞突变状态,转化为骨髓纤维化的发生率(MF)仍有争议。在一项研究中,CALR突变患者从ET为MF转化的发生率比JAK2 突变者显著增高。在其他研究中,两个组之间MF转化的发生率没有显著差异。
  总体生存
  Klampfl等的多变量分析研究表明,JAK2和MPL突变MPN患者死亡高于CALR 突变。Nangalia等报道两个不同ET突变组之间没有明显的生存差异。在一项队列研究观察576例ET患者的结果显示CALR突变不影响生存。另一有关CALR突变对ET长期生存在影响的研究,观察了2006年以前诊断的299例患者,结果显示生存期最短的是MPL突变患者。JAK2患者的中位生存期为19年而CALR突变20年(P =0.32)。这项研究的独特特点是很长的随访时间,提供了ET长期生存的准确估计,并补充了关于特定突变表型和预后的最新信息。
  在PMF,CALR突变对生存是有利的,独立于动态国际预后评分系统(DIPSS)和ASXL1突变状态。三阴性的患者显示白血病转化更少。这些发现提示“CALR( - )/ ASXL1(+)”和“三阴性”为PMF的高风险分子特征。在随后的研究中,570例 PMF患者推导(N =277)和验证(N =293)用于CALR和ASXL1突变分子预后观察。生存期最长的是CALR(+)/ ASXL1( - ),最短的是CALR( - )/ ASXL1(+)。CALR/ ASXL1预后模型是独立于DIPSS的,能有效地识别低中危-1-组患者和高中危-2-组患者生存期。
  ET和PMF诊断和治疗的现状
  在JAK2V617F突变发现后短短几年的MPN诊断取得了长足的进步。新发现的一个重要后果是导致世界卫生组织(WHO)对这些疾病的分类和诊断的修改。JAK2阳性MPN患者共享某些特征,但目前可用的数据不能牢固支持JAK2突变与否的分类管理,因此WHO分类仍然作为临床实践使用的诊断工具。CALR突变的发现是我们对MPNs的发病机制的认识又一个里程碑。对CALR突变评估显著改善了ET和PMF的诊断方法。疑是ET或PMF,最初的突变筛查应从JAK2V617F开始,JAK2V617F阴性再行CALR突变筛查。CALR突变阴性者筛选MPL突变。三阴性是上述三种突变检测均为阴性的患者。CALR突变应列入MPN诊断并整合入后续版本WHO分类体系。与JAK2V617F突变类似,目前试图根据JAK2/ MPL/ CALR突变进行分子诊断仍言之过早,但可能预示MPN的未来。
  原发性血小板增多症患者在血栓形成并发症,CALR突变与JAK2突变相比风险较低,然而目前尚未实施基于突变状态的治疗修改建议。在两例CALR突变原发性血小板增多症患者中,用α干扰素导致持续血液学完全反应,维持治疗的停药后,等位基因突变体的负荷在继续减少,这表明α干扰素可以通过CALR突变靶向治疗细胞,治疗反应是持续的。ruxolitinib治疗PMF的两项临床试验结果表明,这个JAK1和JAK2抑制剂在大多数患者是有效的,无论其是否存在JAK2V617F 突变。事实上,绝大多数患者的非JAK2突变均有CALR突变,这意味着ruxolitinib对CALR突变患者也是有效的。依据CALR和ASXL1突变的分子预后模型,不仅DIPSS加高风险性骨髓纤维化应干细胞移植,CALR( - )/ ASXL1(+)突变状态下的任何风险程度疾病。需要更多的研究来验证“CALR( - )/ ASXL1(+)”突变与“三阴性”考虑预后差的PMF。我相信,在未来骨髓纤维化的风险分层评分中,突变的资料将被集成,这将有利于选择高风险患者进行异体移植。
  展望
  目前仍需要更多的资料才能理解CALR突变在本病的产生和进展过程中的作用。从CALR突变的C-末端结构域的替代读框获得的肽序列代表了癌症特异性表位,这为我们提供了用于免疫治疗靶的机会。

    擅长:血液系统最常见的恶性疾病骨髓增生异常综合征(MDS)的发病机制与临床治疗
    擅长:恶性血液病的诊治,急慢性白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤的诊治
    擅长:骨髓增生异常综合征的诊断治疗,铁过载的诊断及治疗多发性骨髓瘤,淋巴瘤的诊治
    擅长:难治性贫血、全血细胞减少、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、淋巴瘤及白血病等血液肿瘤诊治。
    擅长:骨髓涂片细胞形态学的观察,骨髓活检组织病理学的观察
    擅长:急慢性血液病,恶性淋巴瘤,多发性骨髓瘤、贫血的诊治,恶性血液病的骨髓移植及外周干细胞移植
    擅长:诊治各类血液科常见疾病,以及白血病,淋巴瘤,多发性骨髓病,MDS等
    擅长:血液科常见疾病,如贫血、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病的诊治
    擅长:骨髓增生异常综合征(MDS) 的基础和临床研究
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