免疫印迹法测定乳腺肿瘤患者胸苷激酶

1960年胸腺嘧啶核苷激酶(TK)被证实是胸腺嘧啶核苷(简称胸苷)合成DNA的关键酶,随后的研究表明 [1] ,TK有两种同工酶,为细胞质TK(TK 1 )和线粒体TK(TK 2 ),其中TK 1 与细胞分裂密切相关,在细胞分裂G 1 期含量比较低,到S期后逐渐升高,至G 2 期达到最高,因此,编码TK 1 的mRNA及其表达的蛋白质也就成为细胞增生的标志物。目前,实验室主要采用放射免疫法(RIA)检测血清TK的酶活性,由于 125 I标记脱氧尿嘧啶半衰期短,且具有放射性污染,难于在临床上推广。1996年He等 [2] 报道利用抗 TK 1 多克隆抗体,建立western blotting检测人TK 1 。在此基础上,我们利用抗 TK 1 单克隆抗体,建立点免疫印迹发光法检测乳腺肿瘤患者血清中TK 1 ,可用于乳腺肿瘤诊断、疗效观察、预后及肿瘤病理机制的研究,在鉴定良、恶性乳腺肿瘤取得了良好效果,现初步报告如下。

材料和方法
　　 　 一、材料
　　 1 研究对象:共检测118例患者,其中乳腺肿瘤患者75例,来源于湖北医科大学附属第一医院和Karolinska医院,经病理学确诊,乳腺癌61例(手术前患者14例,淋巴结未转移的手术后患者37例,淋巴结转移的手术后患者10例),乳腺良性肿瘤14例;对照组43例,其中11名为本院体检健康者,32例为本院非肿瘤住院患者(乳腺炎10例,乙型肝炎12例,肺结核10例)。所有研究对象采集静脉血,分离血清,贮存于-20℃备用。
2 硝酸纤维素薄膜(NCM),孔径0.45μm,规格10cm×8cm,浙江黄岩四青生化材料厂生产。
　　 3 主要试剂和仪器:TK 1 单克隆抗体,生物素标记的羊抗鼠抗体(bio anti M),辣根过氧化物酶标记亲和素(avidin HRP),TK 1 标准品(0、5、10、20、40、80、160pmol/L),鲁米诺发光底物和X线片均由瑞典Karolinska大学提供。GS700图像扫描仪为美国Bio Rad公司产品。
　　 二、方法
　　 1 点样,在NCM上每点加血清5μl,同时设立标准品对照(每次测定NCM都有标准品),室温晾干,洗涤3次,每次5min。将NCM37℃振荡封闭2ｈ,加入适量的TK 1 单抗于封闭液中,4℃振荡过夜,漂洗3次,将NCM放于Bio anti M液中,室温振荡作用1ｈ,洗涤同前。加入适当浓度的avidin HRP于NCM容器中,室温1ｈ,洗涤4次。将NCM置于新鲜配制的发光底物中,室温1min,用塑料膜将NCM封好,排除气泡,装于密封夹内,暗室中放入X线片,曝光3min(30min内完成),取片冲洗。
　　 2 结果分析,用GS 700图像扫描仪测定各斑点的吸光度值(A),以标准品的含量对应A值作图进行定量分析,凡是TK 1 浓度大于5pmol/L可判定为异常;也可通过肉眼观察定性分析,斑点颜色深于5pmol/L标准品,即为TK 1 阳性。
　　 三、Western Immunoblottinhg检测血清TK 1 详细操作方法参见有关文献 [2] 。
  检验医学新技术进展 
免疫印迹法测定乳腺肿瘤患者胸苷激酶
 
湖北医科大学附属第一医院检验科 李艳
 
 
　　 1960年胸腺嘧啶核苷激酶(TK)被证实是胸腺嘧啶核苷(简称胸苷)合成DNA的关键酶,随后的研究表明 [1] ,TK有两种同工酶,为细胞质TK(TK 1 )和线粒体TK(TK 2 ),其中TK 1 与细胞分裂密切相关,在细胞分裂G 1 期含量比较低,到S期后逐渐升高,至G 2 期达到最高,因此,编码TK 1 的mRNA及其表达的蛋白质也就成为细胞增生的标志物。目前,实验室主要采用放射免疫法(RIA)检测血清TK的酶活性,由于 125 I标记脱氧尿嘧啶半衰期短,且具有放射性污染,难于在临床上推广。1996年He等 [2] 报道利用抗 TK 1 多克隆抗体,建立western blotting检测人TK 1 。在此基础上,我们利用抗 TK 1 单克隆抗体,建立点免疫印迹发光法检测乳腺肿瘤患者血清中TK 1 ,可用于乳腺肿瘤诊断、疗效观察、预后及肿瘤病理机制的研究,在鉴定良、恶性乳腺肿瘤取得了良好效果,现初步报告如下。

材料和方法
　　 　 一、材料
　　 1 研究对象:共检测118例患者,其中乳腺肿瘤患者75例,来源于湖北医科大学附属第一医院和Karolinska医院,经病理学确诊,乳腺癌61例(手术前患者14例,淋巴结未转移的手术后患者37例,淋巴结转移的手术后患者10例),乳腺良性肿瘤14例;对照组43例,其中11名为本院体检健康者,32例为本院非肿瘤住院患者(乳腺炎10例,乙型肝炎12例,肺结核10例)。所有研究对象采集静脉血,分离血清,贮存于-20℃备用。

　　 2 硝酸纤维素薄膜(NCM),孔径0.45μm,规格10cm×8cm,浙江黄岩四青生化材料厂生产。
　　 3 主要试剂和仪器:TK 1 单克隆抗体,生物素标记的羊抗鼠抗体(bio anti M),辣根过氧化物酶标记亲和素(avidin HRP),TK 1 标准品(0、5、10、20、40、80、160pmol/L),鲁米诺发光底物和X线片均由瑞典Karolinska大学提供。GS700图像扫描仪为美国Bio Rad公司产品。
　　 二、方法
　　 1 点样,在NCM上每点加血清5μl,同时设立标准品对照(每次测定NCM都有标准品),室温晾干,洗涤3次,每次5min。将NCM37℃振荡封闭2ｈ,加入适量的TK 1 单抗于封闭液中,4℃振荡过夜,漂洗3次,将NCM放于Bio anti M液中,室温振荡作用1ｈ,洗涤同前。加入适当浓度的avidin HRP于NCM容器中,室温1ｈ,洗涤4次。将NCM置于新鲜配制的发光底物中,室温1min,用塑料膜将NCM封好,排除气泡,装于密封夹内,暗室中放入X线片,曝光3min(30min内完成),取片冲洗。
　　 2 结果分析,用GS 700图像扫描仪测定各斑点的吸光度值(A),以标准品的含量对应A值作图进行定量分析,凡是TK 1 浓度大于5pmol/L可判定为异常;也可通过肉眼观察定性分析,斑点颜色深于5pmol/L标准品,即为TK 1 阳性。
　　 三、Western Immunoblottinhg检测血清TK 1 详细操作方法参见有关文献 [2] 。

结果　
　 　 一、特异性
　　 1 对照实验:取1份TK 1 阳性血清,分别设立TK 1 单抗、Bio anti M及avidin HRP空白对照,经点免疫印迹发光法测定,发现三者对照点均不显色。
　　 2 TK 1 分子量验证:取10份TK 1 阳性和5份TK 1 阴性血清,40%硫酸铵沉淀,取上清液透析,再进行 Western Immunoblottinhg,结果TK 1 阳性血清在分子量25000处均有显色条带,TK 1 阴性血清无显色。
　　 二、标准曲线的制作不同含量标准品(0、5、10、20、40、80、160pmol/L),经过点免疫印迹发光法测定后,用GS 700图像扫描仪测定各斑点的A值,以标准品浓度值为横坐标,A值为纵坐标制作标准曲线。

　　 三、重复性试验
　　 两份乳腺肿瘤患者血清,应用点免疫印迹发光法在同一NCM上重复测定20次,结果:病例1的TK 1 含量为194pmol/L,标准差为12;病例2血清的TK 1 含量为49pmol/L,标准差为2 1,两者的批内CV分别为0.062和0.043。
　　 四、标本检测各组人群血清TK 1 的含量比较见表1;用点免疫印迹发光法检测血清的X线片结果。
五、乳腺肿瘤患者术后TK 1 的动态变化　 对1例乳腺良性肿瘤患者手术后0、26、37ｄ的血清进行检测,TK 1 分别为9.1、2.5、4.9pmol/L;而另1例淋巴结未转移的乳腺癌患者术后0、21、28、65、77、92ｄ的血清TK 1 分别为91.8、39.7、50.7、20.2、17.5、3.8pmol/L。结果表明,当患者完全康复时,TK 1 呈明显下降趋势。
  检验医学新技术进展 
免疫印迹法测定乳腺肿瘤患者胸苷激酶
 
湖北医科大学附属第一医院检验科 李艳
 
 
　　 1960年胸腺嘧啶核苷激酶(TK)被证实是胸腺嘧啶核苷(简称胸苷)合成DNA的关键酶,随后的研究表明 [1] ,TK有两种同工酶,为细胞质TK(TK 1 )和线粒体TK(TK 2 ),其中TK 1 与细胞分裂密切相关,在细胞分裂G 1 期含量比较低,到S期后逐渐升高,至G 2 期达到最高,因此,编码TK 1 的mRNA及其表达的蛋白质也就成为细胞增生的标志物。目前,实验室主要采用放射免疫法(RIA)检测血清TK的酶活性,由于 125 I标记脱氧尿嘧啶半衰期短,且具有放射性污染,难于在临床上推广。1996年He等 [2] 报道利用抗 TK 1 多克隆抗体,建立western blotting检测人TK 1 。在此基础上,我们利用抗 TK 1 单克隆抗体,建立点免疫印迹发光法检测乳腺肿瘤患者血清中TK 1 ,可用于乳腺肿瘤诊断、疗效观察、预后及肿瘤病理机制的研究,在鉴定良、恶性乳腺肿瘤取得了良好效果,现初步报告如下。

材料和方法
　　 　 一、材料
　　 1 研究对象:共检测118例患者,其中乳腺肿瘤患者75例,来源于湖北医科大学附属第一医院和Karolinska医院,经病理学确诊,乳腺癌61例(手术前患者14例,淋巴结未转移的手术后患者37例,淋巴结转移的手术后患者10例),乳腺良性肿瘤14例;对照组43例,其中11名为本院体检健康者,32例为本院非肿瘤住院患者(乳腺炎10例,乙型肝炎12例,肺结核10例)。所有研究对象采集静脉血,分离血清,贮存于-20℃备用。

　　 2 硝酸纤维素薄膜(NCM),孔径0.45μm,规格10cm×8cm,浙江黄岩四青生化材料厂生产。
　　 3 主要试剂和仪器:TK 1 单克隆抗体,生物素标记的羊抗鼠抗体(bio anti M),辣根过氧化物酶标记亲和素(avidin HRP),TK 1 标准品(0、5、10、20、40、80、160pmol/L),鲁米诺发光底物和X线片均由瑞典Karolinska大学提供。GS700图像扫描仪为美国Bio Rad公司产品。
　　 二、方法
　　 1 点样,在NCM上每点加血清5μl,同时设立标准品对照(每次测定NCM都有标准品),室温晾干,洗涤3次,每次5min。将NCM37℃振荡封闭2ｈ,加入适量的TK 1 单抗于封闭液中,4℃振荡过夜,漂洗3次,将NCM放于Bio anti M液中,室温振荡作用1ｈ,洗涤同前。加入适当浓度的avidin HRP于NCM容器中,室温1ｈ,洗涤4次。将NCM置于新鲜配制的发光底物中,室温1min,用塑料膜将NCM封好,排除气泡,装于密封夹内,暗室中放入X线片,曝光3min(30min内完成),取片冲洗。
　　 2 结果分析,用GS 700图像扫描仪测定各斑点的吸光度值(A),以标准品的含量对应A值作图进行定量分析,凡是TK 1 浓度大于5pmol/L可判定为异常;也可通过肉眼观察定性分析,斑点颜色深于5pmol/L标准品,即为TK 1 阳性。
　　 三、Western Immunoblottinhg检测血清TK 1 详细操作方法参见有关文献 [2] 。

结果　
　 　 一、特异性
　　 1 对照实验:取1份TK 1 阳性血清,分别设立TK 1 单抗、Bio anti M及avidin HRP空白对照,经点免疫印迹发光法测定,发现三者对照点均不显色。
　　 2 TK 1 分子量验证:取10份TK 1 阳性和5份TK 1 阴性血清,40%硫酸铵沉淀,取上清液透析,再进行 Western Immunoblottinhg,结果TK 1 阳性血清在分子量25000处均有显色条带,TK 1 阴性血清无显色。
　　 二、标准曲线的制作不同含量标准品(0、5、10、20、40、80、160pmol/L),经过点免疫印迹发光法测定后,用GS 700图像扫描仪测定各斑点的A值,以标准品浓度值为横坐标,A值为纵坐标制作标准曲线(图1)。

　　 三、重复性试验
　　 两份乳腺肿瘤患者血清,应用点免疫印迹发光法在同一NCM上重复测定20次,结果:病例1的TK 1 含量为194pmol/L,标准差为12;病例2血清的TK 1 含量为49pmol/L,标准差为2 1,两者的批内CV分别为0.062和0.043。
　　 四、标本检测各组人群血清TK 1 的含量比较见表1;用点免疫印迹发光法检测血清的X线片结果见图2。

　　 五、乳腺肿瘤患者术后TK 1 的动态变化　 对1例乳腺良性肿瘤患者手术后0、26、37ｄ的血清进行检测,TK 1 分别为9.1、2.5、4.9pmol/L;而另1例淋巴结未转移的乳腺癌患者术后0、21、28、65、77、92ｄ的血清TK 1 分别为91.8、39.7、50.7、20.2、17.5、3.8pmol/L。结果表明,当患者完全康复时,TK 1 呈明显下降趋势。

讨论
　　 　 正常人细胞中TK 1 的含量极低,只是在细胞过度增生的情况下,才出现高的水平,Ellime等 [3] 报道,恶性贫血患者血清中TK的含量是正常人的40倍,且能作为一些癌症发生、发展和预后的重要指标。我们利用抗TK 1 mAb,建立点免疫印发光法检测乳腺肿瘤患者血清中TK 1 ,通过对方法特异性、重复性的考查,以及经 Western Immuno blottinhg的验证,表明该方法简便易行,可用于血清TK 1 的检测。
　　 从本研究结果看,乳腺癌患者血清TK 1 水平明显高于乳腺良性肿瘤患者,而后者与体检健康者TK 1 无明显差别(Ｐ＞0.05),对于淋巴结未转移的乳腺癌患者,手术后TK 1 水平呈明显下降的趋势。因此,血清TK 1 不仅可以作为乳腺癌诊断的一个敏感性指标,而且也有利于乳腺癌的疗效观察。虽然乳腺癌患者血清TK 1 水平明显高于对照人群,但是乳腺癌患者间TK 1 水平也有差别,可能与肿瘤细胞分化程度和所处细胞周期及肿瘤是否转移有关,有待进一步研究。
　　 血清TK 1 的来源仍不十分清楚,而且它比细胞内提取的TK 1 更稳定,同时,血清TK 1 的水平与肿瘤的性质有关,因此,有学者 [4] 推测,血清TK 1 可能是肿瘤细胞分泌或溶解释放胸苷激酶的聚合体。
　　 国外已有报道,应用酶法 [3] 和Western Blotting [2] 检测血清中TK 1 ,且能进行定量分析。但因这些方法操作繁琐,难以用于临床。我们认为点免疫印迹发光法容易操作,而且利用了发光技术的高灵敏性,通过X线片曝光,避免了使用发光检测仪,且可长期保存实验结果;通过设立标准品对照,根据斑点的深浅进行定量分析。因此,点免疫印迹发光法检测血清TK 1 可作为乳腺肿瘤诊断方法之一,尤其判断良恶性乳腺肿瘤具有很好的应用前景。