免疫印迹法测定乳腺肿瘤患者胸苷激酶

讨论 　　 　 正常人细胞中tk 1 的含量极低,只是在细胞过度增生的情况下,才出现高的水平,ellime等 [3] 报道,恶性贫血患者血清中tk的含量是正常人的40倍,且能作为一些癌症发生、发展和预后的重要指标。我们利用抗tk 1 mab,建立点免疫印发光法检测乳腺肿瘤患者血清中tk 1 ,通过对方法特异性、重复性的考查,以及经 western immuno blottinhg的验证,表明该方法简便易行,可用于血清tk 1 的检测。 　　 从本研究结果看,乳腺癌患者血清tk 1 水平明显高于乳腺良性肿瘤患者,而后者与体检健康者tk 1 无明显差别(ｐ＞0.05),对于淋巴结未转移的乳腺癌患者,手术后tk 1 水平呈明显下降的趋势。因此,血清tk 1 不仅可以作为乳腺癌诊断的一个敏感性指标,而且也有利于乳腺癌的疗效观察。虽然乳腺癌患者血清tk 1 水平明显高于对照人群,但是乳腺癌患者间tk 1 水平也有差别,可能与肿瘤细胞分化程度和所处细胞周期及肿瘤是否转移有关,有待进一步研究。 　　 血清tk 1 的来源仍不十分清楚,而且它比细胞内提取的tk 1 更稳定,同时,血清tk 1 的水平与肿瘤的性质有关,因此,有学者 [4] 推测,血清tk 1 可能是肿瘤细胞分泌或溶解释放胸苷激酶的聚合体。 　　 国外已有报道,应用酶法 [3] 和western blotting [2] 检测血清中tk 1 ,且能进行定量分析。但因这些方法操作繁琐,难以用于临床。我们认为点免疫印迹发光法容易操作,而且利用了发光技术的高灵敏性,通过x线片曝光,避免了使用发光检测仪,且可长期保存实验结果;通过设立标准品对照,根据斑点的深浅进行定量分析。因此,点免疫印迹发光法检测血清tk 1 可作为乳腺肿瘤诊断方法之一,尤其判断良恶性乳腺肿瘤具有很好的应用前景。

　　 五、乳腺肿瘤患者术后tk 1 的动态变化　 对1例乳腺良性肿瘤患者手术后0、26、37ｄ的血清进行检测,tk 1 分别为9.1、2.5、4.9pmol/l;而另1例淋巴结未转移的乳腺癌患者术后0、21、28、65、77、92ｄ的血清tk 1 分别为91.8、39.7、50.7、20.2、17.5、3.8pmol/l。结果表明,当患者完全康复时,tk 1 呈明显下降趋势。

　　 三、重复性试验 　　 两份乳腺肿瘤患者血清,应用点免疫印迹发光法在同一ncm上重复测定20次,结果:病例1的tk 1 含量为194pmol/l,标准差为12;病例2血清的tk 1 含量为49pmol/l,标准差为2 1,两者的批内cv分别为0.062和0.043。 　　 四、标本检测各组人群血清tk 1 的含量比较见表1;用点免疫印迹发光法检测血清的x线片结果见图2。

结果　　 　 一、特异性 　　 1 对照实验:取1份tk 1 阳性血清,分别设立tk 1 单抗、bio anti m及avidin hrp空白对照,经点免疫印迹发光法测定,发现三者对照点均不显色。 　　 2 tk 1 分子量验证:取10份tk 1 阳性和5份tk 1 阴性血清,40%硫酸铵沉淀,取上清液透析,再进行 western immunoblottinhg,结果tk 1 阳性血清在分子量25000处均有显色条带,tk 1 阴性血清无显色。 　　 二、标准曲线的制作不同含量标准品(0、5、10、20、40、80、160pmol/l),经过点免疫印迹发光法测定后,用gs 700图像扫描仪测定各斑点的a值,以标准品浓度值为横坐标,a值为纵坐标制作标准曲线(图1)。

　　 2 硝酸纤维素薄膜(ncm),孔径0.45μm,规格10cm×8cm,浙江黄岩四青生化材料厂生产。 　　 3 主要试剂和仪器:tk 1 单克隆抗体,生物素标记的羊抗鼠抗体(bio anti m),辣根过氧化物酶标记亲和素(avidin hrp),tk 1 标准品(0、5、10、20、40、80、160pmol/l),鲁米诺发光底物和x线片均由瑞典karolinska大学提供。gs700图像扫描仪为美国bio rad公司产品。 　　 二、方法 　　 1 点样,在ncm上每点加血清5μl,同时设立标准品对照(每次测定ncm都有标准品),室温晾干,洗涤3次,每次5min。将ncm37℃振荡封闭2ｈ,加入适量的tk 1 单抗于封闭液中,4℃振荡过夜,漂洗3次,将ncm放于bio anti m液中,室温振荡作用1ｈ,洗涤同前。加入适当浓度的avidin hrp于ncm容器中,室温1ｈ,洗涤4次。将ncm置于新鲜配制的发光底物中,室温1min,用塑料膜将ncm封好,排除气泡,装于密封夹内,暗室中放入x线片,曝光3min(30min内完成),取片冲洗。 　　 2 结果分析,用gs 700图像扫描仪测定各斑点的吸光度值(a),以标准品的含量对应a值作图进行定量分析,凡是tk 1 浓度大于5pmol/l可判定为异常;也可通过肉眼观察定性分析,斑点颜色深于5pmol/l标准品,即为tk 1 阳性。 　　 三、western immunoblottinhg检测血清tk 1 详细操作方法参见有关文献 [2] 。

材料和方法　　 　 一、材料 　　 1 研究对象:共检测118例患者,其中乳腺肿瘤患者75例,来源于湖北医科大学附属第一医院和karolinska医院,经病理学确诊,乳腺癌61例(手术前患者14例,淋巴结未转移的手术后患者37例,淋巴结转移的手术后患者10例),乳腺良性肿瘤14例;对照组43例,其中11名为本院体检健康者,32例为本院非肿瘤住院患者(乳腺炎10例,乙型肝炎12例,肺结核10例)。所有研究对象采集静脉血,分离血清,贮存于-20℃备用。

　　 三、重复性试验 　　 两份乳腺肿瘤患者血清,应用点免疫印迹发光法在同一ncm上重复测定20次,结果:病例1的tk 1 含量为194pmol/l,标准差为12;病例2血清的tk 1 含量为49pmol/l,标准差为2 1,两者的批内cv分别为0.062和0.043。 　　 四、标本检测各组人群血清tk 1 的含量比较见表1;用点免疫印迹发光法检测血清的x线片结果。五、乳腺肿瘤患者术后tk 1 的动态变化　 对1例乳腺良性肿瘤患者手术后0、26、37ｄ的血清进行检测,tk 1 分别为9.1、2.5、4.9pmol/l;而另1例淋巴结未转移的乳腺癌患者术后0、21、28、65、77、92ｄ的血清tk 1 分别为91.8、39.7、50.7、20.2、17.5、3.8pmol/l。结果表明,当患者完全康复时,tk 1 呈明显下降趋势。   检验医学新技术进展  免疫印迹法测定乳腺肿瘤患者胸苷激酶  湖北医科大学附属第一医院检验科 李艳   　　 1960年胸腺嘧啶核苷激酶(tk)被证实是胸腺嘧啶核苷(简称胸苷)合成dna的关键酶,随后的研究表明 [1] ,tk有两种同工酶,为细胞质tk(tk 1 )和线粒体tk(tk 2 ),其中tk 1 与细胞分裂密切相关,在细胞分裂g 1 期含量比较低,到s期后逐渐升高,至g 2 期达到最高,因此,编码tk 1 的mrna及其表达的蛋白质也就成为细胞增生的标志物。目前,实验室主要采用放射免疫法(ria)检测血清tk的酶活性,由于 125 i标记脱氧尿嘧啶半衰期短,且具有放射性污染,难于在临床上推广。1996年he等 [2] 报道利用抗 tk 1 多克隆抗体,建立western blotting检测人tk 1 。在此基础上,我们利用抗 tk 1 单克隆抗体,建立点免疫印迹发光法检测乳腺肿瘤患者血清中tk 1 ,可用于乳腺肿瘤诊断、疗效观察、预后及肿瘤病理机制的研究,在鉴定良、恶性乳腺肿瘤取得了良好效果,现初步报告如下。

结果　　 　 一、特异性 　　 1 对照实验:取1份tk 1 阳性血清,分别设立tk 1 单抗、bio anti m及avidin hrp空白对照,经点免疫印迹发光法测定,发现三者对照点均不显色。 　　 2 tk 1 分子量验证:取10份tk 1 阳性和5份tk 1 阴性血清,40%硫酸铵沉淀,取上清液透析,再进行 western immunoblottinhg,结果tk 1 阳性血清在分子量25000处均有显色条带,tk 1 阴性血清无显色。 　　 二、标准曲线的制作不同含量标准品(0、5、10、20、40、80、160pmol/l),经过点免疫印迹发光法测定后,用gs 700图像扫描仪测定各斑点的a值,以标准品浓度值为横坐标,a值为纵坐标制作标准曲线。

　　 2 硝酸纤维素薄膜(ncm),孔径0.45μm,规格10cm×8cm,浙江黄岩四青生化材料厂生产。 　　 3 主要试剂和仪器:tk 1 单克隆抗体,生物素标记的羊抗鼠抗体(bio anti m),辣根过氧化物酶标记亲和素(avidin hrp),tk 1 标准品(0、5、10、20、40、80、160pmol/l),鲁米诺发光底物和x线片均由瑞典karolinska大学提供。gs700图像扫描仪为美国bio rad公司产品。 　　 二、方法 　　 1 点样,在ncm上每点加血清5μl,同时设立标准品对照(每次测定ncm都有标准品),室温晾干,洗涤3次,每次5min。将ncm37℃振荡封闭2ｈ,加入适量的tk 1 单抗于封闭液中,4℃振荡过夜,漂洗3次,将ncm放于bio anti m液中,室温振荡作用1ｈ,洗涤同前。加入适当浓度的avidin hrp于ncm容器中,室温1ｈ,洗涤4次。将ncm置于新鲜配制的发光底物中,室温1min,用塑料膜将ncm封好,排除气泡,装于密封夹内,暗室中放入x线片,曝光3min(30min内完成),取片冲洗。 　　 2 结果分析,用gs 700图像扫描仪测定各斑点的吸光度值(a),以标准品的含量对应a值作图进行定量分析,凡是tk 1 浓度大于5pmol/l可判定为异常;也可通过肉眼观察定性分析,斑点颜色深于5pmol/l标准品,即为tk 1 阳性。 　　 三、western immunoblottinhg检测血清tk 1 详细操作方法参见有关文献 [2] 。

材料和方法　　 　 一、材料 　　 1 研究对象:共检测118例患者,其中乳腺肿瘤患者75例,来源于湖北医科大学附属第一医院和karolinska医院,经病理学确诊,乳腺癌61例(手术前患者14例,淋巴结未转移的手术后患者37例,淋巴结转移的手术后患者10例),乳腺良性肿瘤14例;对照组43例,其中11名为本院体检健康者,32例为本院非肿瘤住院患者(乳腺炎10例,乙型肝炎12例,肺结核10例)。所有研究对象采集静脉血,分离血清,贮存于-20℃备用。

材料和方法　　 　 一、材料 　　 1 研究对象:共检测118例患者,其中乳腺肿瘤患者75例,来源于湖北医科大学附属第一医院和karolinska医院,经病理学确诊,乳腺癌61例(手术前患者14例,淋巴结未转移的手术后患者37例,淋巴结转移的手术后患者10例),乳腺良性肿瘤14例;对照组43例,其中11名为本院体检健康者,32例为本院非肿瘤住院患者(乳腺炎10例,乙型肝炎12例,肺结核10例)。所有研究对象采集静脉血,分离血清,贮存于-20℃备用。 2 硝酸纤维素薄膜(ncm),孔径0.45μm,规格10cm×8cm,浙江黄岩四青生化材料厂生产。 　　 3 主要试剂和仪器:tk 1 单克隆抗体,生物素标记的羊抗鼠抗体(bio anti m),辣根过氧化物酶标记亲和素(avidin hrp),tk 1 标准品(0、5、10、20、40、80、160pmol/l),鲁米诺发光底物和x线片均由瑞典karolinska大学提供。gs700图像扫描仪为美国bio rad公司产品。 　　 二、方法 　　 1 点样,在ncm上每点加血清5μl,同时设立标准品对照(每次测定ncm都有标准品),室温晾干,洗涤3次,每次5min。将ncm37℃振荡封闭2ｈ,加入适量的tk 1 单抗于封闭液中,4℃振荡过夜,漂洗3次,将ncm放于bio anti m液中,室温振荡作用1ｈ,洗涤同前。加入适当浓度的avidin hrp于ncm容器中,室温1ｈ,洗涤4次。将ncm置于新鲜配制的发光底物中,室温1min,用塑料膜将ncm封好,排除气泡,装于密封夹内,暗室中放入x线片,曝光3min(30min内完成),取片冲洗。 　　 2 结果分析,用gs 700图像扫描仪测定各斑点的吸光度值(a),以标准品的含量对应a值作图进行定量分析,凡是tk 1 浓度大于5pmol/l可判定为异常;也可通过肉眼观察定性分析,斑点颜色深于5pmol/l标准品,即为tk 1 阳性。 　　 三、western immunoblottinhg检测血清tk 1 详细操作方法参见有关文献 [2] 。   检验医学新技术进展  免疫印迹法测定乳腺肿瘤患者胸苷激酶  湖北医科大学附属第一医院检验科 李艳   　　 1960年胸腺嘧啶核苷激酶(tk)被证实是胸腺嘧啶核苷(简称胸苷)合成dna的关键酶,随后的研究表明 [1] ,tk有两种同工酶,为细胞质tk(tk 1 )和线粒体tk(tk 2 ),其中tk 1 与细胞分裂密切相关,在细胞分裂g 1 期含量比较低,到s期后逐渐升高,至g 2 期达到最高,因此,编码tk 1 的mrna及其表达的蛋白质也就成为细胞增生的标志物。目前,实验室主要采用放射免疫法(ria)检测血清tk的酶活性,由于 125 i标记脱氧尿嘧啶半衰期短,且具有放射性污染,难于在临床上推广。1996年he等 [2] 报道利用抗 tk 1 多克隆抗体,建立western blotting检测人tk 1 。在此基础上,我们利用抗 tk 1 单克隆抗体,建立点免疫印迹发光法检测乳腺肿瘤患者血清中tk 1 ,可用于乳腺肿瘤诊断、疗效观察、预后及肿瘤病理机制的研究,在鉴定良、恶性乳腺肿瘤取得了良好效果,现初步报告如下。

1960年胸腺嘧啶核苷激酶(tk)被证实是胸腺嘧啶核苷(简称胸苷)合成dna的关键酶,随后的研究表明 [1] ,tk有两种同工酶,为细胞质tk(tk 1 )和线粒体tk(tk 2 ),其中tk 1 与细胞分裂密切相关,在细胞分裂g 1 期含量比较低,到s期后逐渐升高,至g 2 期达到最高,因此,编码tk 1 的mrna及其表达的蛋白质也就成为细胞增生的标志物。目前,实验室主要采用放射免疫法(ria)检测血清tk的酶活性,由于 125 i标记脱氧尿嘧啶半衰期短,且具有放射性污染,难于在临床上推广。1996年he等 [2] 报道利用抗 tk 1 多克隆抗体,建立western blotting检测人tk 1 。在此基础上,我们利用抗 tk 1 单克隆抗体,建立点免疫印迹发光法检测乳腺肿瘤患者血清中tk 1 ,可用于乳腺肿瘤诊断、疗效观察、预后及肿瘤病理机制的研究,在鉴定良、恶性乳腺肿瘤取得了良好效果,现初步报告如下。