中华传染病杂志 2003年6月第21卷第3期 

　　                一起由屎肠球菌引起的人、猪败血症暴发流行的相关性复旦大学附属华山医院感染病科尹有宽

　　           卢洪洲 翁心华 章幼弈 庞茂银 尹有宽 汤一苇 李海静孟淑芳 华文久 闻玉梅

　　【摘要】 目的通过基因分析研究引起人、猪败血症暴发流行的屎肠球菌的相关性。方法 随机对患者和病猪的血培养分离菌进行16S核糖体RNA基因(16S rRNA基因或16SrDNA)测序，与基因库中菌种比较，从基因水平上确定细菌种类。分别将人、猪血液分离菌基因组经20 U SamI酶消化后经脉冲场凝胶电泳(PFGE)，确定两者的相关性。结果 16S rRNA基因测序分析证明人、猪分离菌100％ 相同，与基因库中原型屎肠球菌仅相差一个核苷酸(99．9％ 相同)，两株细菌全基因组经 SamI酶消化后PFGE谱完全一致。结论此起暴发流行是由猪传播的屎肠球菌败血症所致。【关键词】 16S核糖体RNA基因；脉冲场凝胶电泳；屎肠球菌 Study on the relationship of an outbreak of Enterococcus facium sepsis between humans and pigs LU Hong-zhou．W ENG Xin―hua zHANG You―yi，et a1． Deparlment of Infectious Diseases，Huashan Hospital，Fudan University， Shanghai 200040，China 【Abstract】Objective To assess the epidemiological relatedness on an outbreak of Enterococcus厂nci― Um sepsis between humans and pigs based on genomic analysis．M ethods Two bacterial isolates recovered randomly from the blood of one patient and one pig were analyzed for homogeneities by compariso n with 1 6S rRNA gene sequences in the GeneBank．M oreover，The extracted genom ic DNA was diges ted with the 20u Sam I enzym e respectively，then their interrelationship was perform ed according to the pulsed field gel electrophoresis．Results Sequences determined from both human and pig isolates were 100％ identical and most closely related to E．facium ．diverging from the prototype sequence by one nucleotide(99．9％ simi― larity)and displayed indistinguishable pulsed field gel electrophoresis patterns．Conclusions These data demonstrate epidemiological related ness of the bacterial iso lates，and suggest spread of an E ． cium ―relat― ed sepsis outbreak from pigs to hum ans．【Key words】 16S rRNA gene；Pulsed field gel electrophoresis；Enterococcus faecium 1998年7月下旬至9月初，江苏省部分地区有成批生猪发病，死亡数千头，与病猪接触的农民也有40人发病，其中12(30％)例死亡。疾病暴发流行时收集到的所有患者的阳性标本、病猪血液阳性标本经生化鉴定均为屎肠球菌，人、猪分离菌的药敏结果也完全一致_】．2 J。本文是在临床流行病学调查及对致病菌的表现型鉴定均为屎肠球菌的基础上，应用分子生物学方法对人、猪血液分离菌 进行深入研究，以期了解人、猪感染的分子流行病学相关性[ 。材料和方法一、菌株来源和保存将一70。c保存的患者、病猪阳性血液标本分别放入5％ 羊血平皿，于35。C、5％CO 温箱温育 24 h复苏。所有生长菌经API ATB系统进行生化鉴定(API Strep，BioMero，莫里艾公司，法国)均为屎肠球菌。随机对1例患者和1头病猪的血液标本进行增菌培养。对照菌株采用流行期间当地正常健康人肠道分离的屎肠球菌(华山医院鉴定  华山医院临床分离鉴定的屎肠球菌和美国范登堡大学医学院临床分离鉴定的屎肠球菌。二、16S rRNA基因测序细菌DNA 抽提应用QIAamp DNA 试剂盒 (QIAgen 公司，美国)，按说明步骤操作。16S rRNA基因引物设计及PCR扩增条件参照文献进行l4’ ，16S rRNA 全基因扩增(PCR System9700 扩增仪，美国)保守序列引物为：0005F和1540R，采用大肠埃希菌基因组DNA为阳性对照，去离子水为阴性对照，热循环参数为：95。C，起始10 min； 95。C，30 S；60。C，30 S；72。C，45 S；共35个循环，最后一个循环72。C，延伸10 min。PCR产物应用 Sap 和ExoI酶纯化。测序PCR 采用引物为： 0005F， 0338F， 0357R ， 0515F ， 0531R ， 0776F ， 08l0R，1087F，1104R，1174F，1193R 和1540R。热循环参数为：95。C，起始2 min；95。C，30 S；60。C， 20 S；72。C，2 min；共35个循环，最后一个循环 72℃ ，延伸4 min。测序仪为OpenGen(Visible Ge― netics Inc，加拿大)。三、统计学处理测序结果与应用生物系统基因库(MicroSeq Applied Biosystem，Foster City，CA， 美国)中 1 100种以上的16S rRNA基因序列比较，分析软件采用Epiinfo 6．0系统(CDC，Atlanta，Ga．)，P <0．05为差异有显著性l5 J。种系发生相关性采用毗邻一相接方法(Neighbor―joining method)分析。四、PFGE分析基因组DNA 试剂和方法按文献[6]进行。细菌在脑心浸液 (BHI)培养基中培养到对数生长期，将菌体溶解在低熔点凝胶(Bio―Rad，Hercules，CA，美国)中，先用链球菌溶解液将菌体溶解，分别用20 U 的Sn― mI酶(New England Biolabs，Beverly，Mass)过夜，消化凝胶栓中的基因组DNA，然后按说明将凝胶栓放入嵌位均匀电场电泳仪(CHEF DR III，Bio― Rad Laboratories，Hercules，CA，美国)于14。C电泳l8．5 h，电泳结束后，用溴化乙锭染色后成相。 Sa mI酶消化肠球菌基因组，可使其降解为15～20 个限制性片段，片段大小为5～400 kbp。PFGE结果采用Tenover[ 等制定的标准进行分析：若不相同的限制性片段有2～3个，则两株克隆密切相关 (closely related)；若不相同的限制性片段有4～6 个，则两株克隆可能相关(possible related)；若不相同的限制性片段≥7个，则两株克隆不相关(differ― ent)；若所有限制性片段均一致，则两株细菌来自同一克隆(indistinguishable)。标准DNA 由噬菌体组成，梯度以48．5 kbp为倍数增长(Bio―Rad Lab― oratories，Hercules，CA，美国)。结 果一、16S rRNA基因测序分别对患者和病猪血液分离菌进行16S rRNA 基因测序，两者序列100％ 相同。分离菌 16S rRNA基因序列与基因库中13种肠球菌的 16S rRNA基因组中1554～1556对核苷酸比较，与屎肠球菌原型仅有一个核苷酸位点不同 (A196G)。图1为应用毗邻一相接方法，与基因库中13种肠球菌的16S rRNA基因序列比较所得的种系发育树。图1 肠球菌16S rRNA 基因组序列种系发胃树图中种系发生相关性是比较基因库中13种肠球菌的16S rRNA基因组序列差别后得出的结果。 2．513％的图标距离(直线长度)表示种系发生的相对差异比例。表1为应用MicroSeq BLAST 软件分析的数据，待测病原菌与基因库中屎肠球菌核苷酸差异率仅为0．13％ 。二、基因组DNA酶切图谱患者和病猪的血培养分离菌及对照菌经20U Sa mI酶切后PFGE图谱，见图2。图中可看出患者和病猪的血培养分离菌经 SamI酶切后限制性片段(电泳带)完全相同，说明两者来自同一克隆。而其与3株对照菌的限制性片段差别均超过7条，说明无相关性。甄 一维普资讯 http://www.cqvip.com 2003年6月第21卷第3期 Chin J Infect Dis，Iune 2003，vo】21．No3 表1 肠球菌16S rRNA基因组序列差异百分比一339．5 ― 291 0 ― ― 242．5 ― 194．0 ― 145．5 ― 97．0 ― 48．5 1．患者分离菌；2．病猪分离菌；3．流行期间南通当地健康人肠遭分离经华山医院鉴定的屎肠球菌；4．华山医院临床分离鉴定的屎肠球菌；5．美国范登堡大学医学院临床分离鉴定的屎肠球菌图2 经SamI酶切后屎肠球菌PFGE图谱讨 论肠球菌是人和动物消化道的正常寄生菌。少数情况下可见于阴道和口腔分泌物。肠球菌可引起多种感染，如泌尿道和腹腔内伤口感染，有时可导致菌血症和心内膜炎。尽管其本身的致病力较弱，但是院内感染的主要致病菌之一 J。粪肠球菌和屎肠球菌是最主要的肠球菌种，最近研究表明，粪肠球菌所致感染约占80％ ～9O％ ，远高于第 2位的屎肠球菌，因此通常需要对此作出鉴别。屎肠球菌约占肠球菌临床分离株的1O％ ，但是由于其对B一内酰胺类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素固有的耐药性而容易导致更高的病死率[10,11]。尽管已有研究表明，屎肠球菌可以在人与动物之间进行水平传播，但是屎肠球菌引起的人畜共患病目前尚未见报道l12, J。由于屎肠球菌可以寄居在胃肠道，并且具有固有的和获得的耐药性，因而它引起机会性感染后给临床治疗带来很多麻烦。 Bogaard等 1 报道1例荷兰农民及其饲养的火鸡体内分离到的万古霉素耐药肠球菌具有完全一致的PFGE谱，说明密切接触可引起人兽共同感染。 Jenson等 1 3J发现在丹麦家禽分离的屎肠球菌株有两种类型，而这两型在人体内都被发现，说明均可感染人类。因此，我们可以假设原发感染为从动物向人的传播，而不是其他的途径。有研究表明，在丹麦的住院患者和病猪体内分离到PFGE一致的耐万古霉素屎肠球菌含有相同的Tn1546因子，进一步证实了万古霉素耐药肠球菌(VRE)可在动物与人之间进行传播。屎肠球菌可引起脑膜炎，31％的脑膜炎患者同时有肠球菌其他部位感染，由肠球菌引起的脑膜炎病死率为13％。屎肠球菌脑膜炎患者多有基础疾病或接受过免疫抑制治疗，1／3以上的成年患者有头颅外伤的病史。无论是新生儿还是成人发生 VRE感染，治疗都很困难。因为其对所有B内酰胺类抗生素都耐药，而万古霉素和壁霉素(te― icoplanin)又难以进入脑脊液 。肠球菌菌血症比肠球菌心内膜炎更为常见。不伴有心内膜炎的肠球菌菌血症常来自于尿路感染。腹腔感染、胆道、盆腔和伤口感染也较为常见。其他原因包括烧伤、围产期的母亲和婴儿、骨骼感染以及静脉留置导管继发感染。屎肠球菌菌血症的病死率可达34％ ～44％ Ⅲ1 ，大多死于并发症。我们研究了本起在数千头猪和40例患者中出现的败血症暴发流行情况。根据从患者和病猪血中分离到的菌株的表现型及基因型特征，包括生化特性Ⅲ1’2 J和16S rRNA基因测序，确认为屎肠球菌。所有从患者和病猪血中分离到的菌株基因组酶解后在脉冲场电泳中呈现相同的电泳带，说明这些菌株具有同源性(来自同一克隆)。从患者和病猪血和／或脑脊液中分离到的肠球菌均为屎肠球菌，而与流行区对照株无相关性，这为证实致病性屎肠球菌在猪与人之间的传播提供了强有力的分子流行病学依据。约有35％的患者表现出类似中毒性休克综合征(TSS)的症状和体征⋯ 。这些现象或许可以说明，这次人猪共患的败血症可能是由屎肠球菌携带的一种新的致TSS基因所致。链球菌属于肠球菌属，在血平皿上都可呈现溶血环，生化特性上也具有某些相似性。链球菌致热性外毒素 (SPEs)，又名红疹毒素，包括血清型A、B、C、D、F、 G和H，可引起发热、皮疹和TSS等严重的临床表现f】 。我们曾应用已知SPEs基因为探针检测屎肠球菌分离株，没有发现同源性。我们对这种可能的新的致病基因正在进行深入的研究。

　　  参 考 文 献

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　　 (收稿日期：2002．12．16) (本文编辑李欣)