疟原虫乳酸脱氢酶活性检测法和有限稀释法在筛选和建立恶性疟原虫克隆株时的应用

　　建立恶性疟原虫克隆株存在着两个技术难点：一是怎样对原虫感染率、原虫绝对数均小的标本进行疟原虫检测；二是怎样从一个疟原虫分离株中选择一个疟原虫。针对这两个问题，我所在建立恶性疟原虫克隆株过程中，检测微量疟原虫时采用乳酸脱氢酶活性检测法。在分离疟原虫个体时采用有限稀释法，对疟原虫高度且有限地稀释，以实现对疟原虫个体的分离，获得成功，为建立疟原虫克隆株奠定了基础。现报告如下：

　　1　乳酸脱氢酶活性检测法

　　1.1　材料

　　FCC1／HN恶性疟原虫分离株来自北京生物制品所，80年代引入本所。连续培养及液氮冻存至今。Malstat、NBT、Diaphorase购自Flow.Inc(Partland,OR)。RPMI1640培养基粉为Life Technologies,Inc产品。Hepes粉为上海生工生物工程公司产品。“O”型人红细胞及人血清为自制。

　　1.2　原虫克隆化操作

　　用“O”型人红细胞及含15%人血清的完全1640培养液将疟原虫感染率为2%、以环状体(小滋养体)期疟原虫为主的体外培养原虫血稀释成0.5虫／20μl及0.2虫／20μl两种稀释度后，按每孔0.5虫和0.2虫分别加量于4块96孔微量培养板进行微量培养，每孔用完全1640培养液补足成100μl，并保证5%CO2气体量，37℃±0.2℃环境培养一周后，吸弃上清液，孔底沉淀加入红细胞压积占1%的完全1640混悬液100μl再继续培养。

　　1.3　乳酸脱氢酶活性测定

　　将以上培养的原虫再持续一周后按Goodyer方法进行原虫乳酸脱氢酶活性测定：96孔微量板的每孔留红细胞压积1%的红细胞悬液20μl、并于每孔加入100μl Malstat 10μl，1mg/ml NBT10μl，0.1mg/ml Diaphorase 10μl混均后20℃环境静置30分钟，用5%醋酸50μl终止反应，肉眼观察各孔颜色改变，若未出现紫色，则将每孔的上清液吸弃，沉淀加入红细胞压积占1%的完全1640培养液100μl继续培养一周后再进行乳酸脱氢酶活性测定。

　　1.4　结果

　　检测3块0.5个虫／孔的微量培养板，颜色呈紫色的5孔、阳性率为1.736%。另3块0.2个虫／孔的微量培养板，颜色呈紫色的2孔，阳性率为0.694%。阳性孔中有两孔加完反应试剂后立即呈现紫色改变。

　　2　有限稀释法

　　2.1　材料

　　与乳酸脱氢酶活性测定使用材料相同。

　　2.2　培养同步原虫

　　在连续培养期内，营养液中含15%人血清，pH7.0，CO2比例为5%，环境温度37℃±0.2℃，使无性体稳定增殖5～10代，待无性体密度为5%±，环状体原虫占30%以上时，用山梨醇作同步处理，待原虫又增殖两代时，再用山梨醇处理，当环状体的比例超过70%时，即可用作有限稀释的样本。

　　2.3　有限稀释操作

　　将以上原虫比例的原虫血0.3ml压积，先用已洗涤的“O”型人红细胞悬液将原虫感染率调整为1%、红细胞体积占50%的悬液1.2ml。取适量悬液作4次稀释、一步处理，即每次稀释以50%“O”型人红细胞悬液1ml稀释上一稀释度的原虫血，4次稀释所取的原虫感染血量分别为20μl、102μl、110.2μl、111μl，经第4次稀释所得的1 111μl50%红细胞悬液中约含920个疟原虫，取其中555μl悬液用18.7ml含15%人血清的完全1640培养液混悬，此液为红细胞压积1.4%，每20μl含0.5个原虫。另从上述1111μl悬液中取222.2μl，加入50%“O”型人红细胞悬液333μl，再用18.7ml完全1640培养液混悬，此液为红细胞压积1.4%，每20μl容积可含0.2个原虫。

　　2.4　结果

　　终浓度为0.5个原虫／孔的悬液共19.7ml其中含460个原虫，按每孔20μl，原虫数为0.5个分配，可用于10块96孔微量培养板。终浓度为0.2个原虫／孔的悬液亦得19.7ml，内含184个原虫，按每孔20μl，原虫数为0.2个分配，可用于10块96孔微量培养板。按上述标准对6块96孔板进行加样，0.5个虫／孔及0.2个虫／孔，各得3块，按前述条件培养两周。因污染和培养液外溢各弃1块，对余下的4块微量培养板内培养物进行乳酸脱氢酶活性检测，0.5虫／孔及0.2虫／孔的阳性率分别为1.736%和0.694%。

　　3　小结

　　此次实验表明：按Goodyer介绍的方法进行疟原虫乳酸脱氢酶活性检测，用肉眼观察克隆孔中微量培养物中是否有疟原虫存在是可行的。由于培养物不因检测而丢失，使疟原虫继续保持在无菌的环境里。至于疟原虫在极低密度要培养多久才能检出疟原虫乳酸脱氢酶，以及可否只取培养上清液检测，有待探索。

　　本次实验所用两种终稀释度的克隆阳性率，0.5虫／孔为1.736%，0.2虫／孔为0.694%，均低于对应稀释度的理论克隆阳性率，说明该有限稀释过程是可信的。但如此低的阳性率也提示我们，可以考虑选用1虫／孔的终稀释度进行疟原虫克隆株培养，因为微量培养后的较高阳性率可为疟原虫克隆株的筛选提供更多的材料