杜氏利什曼原虫前鞭毛体的培养和染色方法的改进

　　诊断黑热病最可靠的方法是检查病人体内有无病原体。但有时由于所得的材料含虫量较少，涂片检查往往为阴性，给诊断带来一定困难。为提高病原体检出率和诊断率，常采用体外培养法培养出前鞭毛体(promastigote)后再进行制片，染色。培养时一般多采用三N(Nory-MacNeal-Nicoll)培养基，但通过多年实践，我们发现三N培养基由于温度的作用和在试管内较长时间的液体浸泡，使培养基变得脆而软，制片时出现许多琼脂碎片；涂片前也因反复洗涤离心的作用均影响了制片效果。为提高黑热病诊断依据和制片的质量，我们经反复试验，对三N培养基和涂片染色法进行了某些改进，效果很好。现介绍如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　三N培养基础

　　琼脂18g(原为14g);氧化钠6g;蒸馏水900mL

　　在培养之前加入培养基全量1/4量的消毒去纤维蛋白的兔血(即3mL溶解琼脂加入1mL兔血混匀)，操作步骤按人体寄生虫学(中山医学院，1979)介绍的原方法，但由试管法改用小平皿培养法。培养时将取自患者体内的材料(如骨髓液、淋巴结穿刺液)或阳性的鼠肝、脾组织的虫体悬液(用研钵研磨成匀浆而成)，用白金耳挑取，直接接种于小平皿培养基的表面，接种前将培养基内加入青霉素、链霉素各2万单位，防止污染，置22～25℃温箱内培养10～12天，以上操作均要求严格无菌。

　　1.2　涂片

　　以往所用的前鞭毛体涂片染色法，一般将含有前鞭毛体的培养基经3次洗涤离心后做涂片染色，我们发现经离心洗涤后的前鞭毛体虽然较纯净，但大部分前鞭毛体的鞭毛被折断脱落，前鞭毛体聚结在一起的菊花状排列被冲散，失去了自然状态。为弥补上述不足，我们将涂片染色也予以改进。

　　1.2.1　涂片时间：选择经三N培养基培养10天的前鞭毛体做涂片染色，此时的前鞭毛体生长正值旺盛阶段，其外型及内部结构完好清晰，为涂片染色的最好时机。

　　1.2.2　涂片方法：先在干净的玻片上加一小滴生理盐水，再用白金耳挑取小平皿培养基表面的虫落，然后在玻片的生理盐水上轻蘸一下，用手轻摇玻片，使水滴散开，晾干后，甲醇固定，姬氏染色。

　　1.3　染色

　　姬氏染液(Giemsa's stain)加温染色法：(1)姬氏染液的配制：按常规方法(中山医学院，1979)配制姬氏染液。(2)染色方法：将姬氏染液与pH值7.0的缓冲蒸馏水以1∶15的比例稀释混匀后进行染色，将染色缸置入37℃水浴箱中，加温染色40～60min，以加强虫体对染液的渗透力。然后用蒸馏水冲洗晾干后，用加拿大胶封片。

　　2　结果和讨论

　　(1)将三N培养基由试管培养法改为小平皿培养法的优点是：如培养基有污染时，还可挑取尚未污染处的虫落做传代和染色用，不需要重新培养，即省时又省料。同时用直接接种法培养可减轻液体对琼脂的浸泡，从而减少了制片时琼脂碎片的残留。

　　(2)用此染色法制做的前鞭毛体标本片，片面干净，虫体形态完好，内部结构清晰，鞭毛体的细胞质呈浅蓝色，细胞核、基本和鞭毛为红色、杆状的动基体为紫红色，而且不易褪色，如果保存在标本盒内不见阳光，10余年后仍完好如初。由于未经离心，前鞭毛体的鞭毛不易被折断，集结在一起的前鞭毛体也不易被冲散，而保持了其菊花状的自然状态。

参考文献

　　1，中山医学院，编.1979.人体寄生虫学(第1版).北京：人民卫生出版社，314，348.