转染双启动子杆状病毒表达载体在昆虫细胞共表达人白细胞介素12

　　【 摘要 】　目的　通过体外表达rhIL-12，以供研究其在体内外的生物学效应。方法　外周血单个核细胞(PBMC)、粘附细胞和人口腔表皮样癌细胞KB分别经SAC(含A蛋白的金黄色葡萄球菌CowanⅠ菌株)、IFN-γ＋LPS和PDBu(12，13-二丁酸佛波酯)刺激，以GIT(异硫氰酸胍)一步法提取细胞总RNA，经RT-PCR技术获取IL-12 P40和P35 cDNA，将两条基因分别插入双启动子杆状病毒转染载体pAcUW51的多角子启动子和P10启动子下游，构建真核表达载体pAcUW51/IL-12，与AcNPV共转染昆虫细胞Sf9，获取表达IL-12的细胞株，表达产物分别经SDS-PAGE，Western blot，ELISA和生物学活性鉴定。结果　rhIL-12产物的相对分子质量(Mr)经SDS-PAGE和Western blot鉴定为67×103，表达水平为15.4～15.7μg/106细胞。MTT法检测IL-12表达产物促进NK细胞杀伤K562细胞的能力比对照可提高60%，刺激PHA激活的PBMC增殖的能力最高可达到58%。结论　成功构建了双启动子杆状病毒表达载体pAcUW51/IL-12，获得了共表达IL-12 P40和P35亚单位的昆虫细胞株。

Coexpression of human IL-12 in insect cells transfected by double promoter baculovirus expression vector

WEI Haiming, TIAN Zhigang, FENG Jinbo, et al.

　　(Shandong Cancer Biotherapy Center, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji′nan 250062, P. R. China)

　　【 Abstract 】　Objective　Interleukin 12 (IL-12) is a heterodimeric cytokine composed of two covalently linked chains, P40 and P35. It is necessary to express recombinant human IL-12 for studying the biological effects of this cytokine in vivo and in vitro.Methods　Peripheral blood mononuclear cells (PBMC), adherent cells and KB cell line were treated with Staphylococcus aureus CowanⅠ strain (SAC), IFN-γ+LPS and PDBu, respectively. Total RNA was extracted from these cells by the guanidine isothiocyanate method. cDNA for both P40 and P35 subunits of IL-12 were cloned by RT-PCR. Double promoter eukaryotic expression vectors, pAcUW51/IL-12 containing IL-12 P35 and P40 cDNA, were constructed. The vectors were used to co-transfect the insect cells (Sf9) with linearized polyhedrosis virus genomic DNA. The cell clones expressed the rhIL-12 products were analyzed by SDS-PAGE, Western blot, ELISA and biological assays.Results　The molecular weight of recombinant human IL-12 products is about 67kD on SDS-PAGE and Western blot in non-reducing conditions. The expression level of recombinant human IL-12 was about 15.4μg-15.7μg/106 cells. The biological activities identified by two biological assays showed that the expressed products increased the proliferation of human PHA-activated PBMC and also the human NK cell-mediated cytotoxicity.Conclusion　Double promoter baculovirus expression vector pAcUW51/IL-12 was successfully constructed and both P40 and P35 subunits of IL-12 were correctly coexpressed in insect cells.

　　【 Subject words 】　Interleukin 12; Expression; Baculovirus expression vector

　　白细胞介素12(IL-12)主要是由抗原提呈细胞产生的一种异二聚体(P40和P35)细胞因子，能显著增强NK/LAK细胞的杀伤活性，促进特异性CTL细胞的应答能力，诱导T细胞和NK细胞大量分泌IFN-γ，启动TH0细胞向TH1细胞的发育，在抗肿瘤、艾滋病等多种疾病中将发挥重要作用〔1〕。我们用SAC、LPS、IFN-γ和PDBu等刺激剂作用于外周血单个核细胞或口腔表皮样癌细胞株KB，成功扩增出IL-12 P40和P35 cDNA，并插入双启子杆状病毒表达载体pAcUW51,转染昆虫细胞Sf9，获得高表达IL-12的细胞株，现将有关结果报告如下。

　　材料和方法

　　细胞株、菌株与载体：人口腔表皮样癌细胞株KB购自中科院上海细胞所，K562、Raji和Sf9细胞为本室保存。E.coli DH5α和含A蛋白金黄色葡萄球菌为本室保存菌株，双启动子杆状病毒转染载体pAcUW51购自PharMingen，含多角体启动子和P10启动子，可同时表达两条多肽链。

　　引物设计与合成：根据文献〔2〕设计6条引物P1～P6，序列及扩增片段见表1，P1/P2引入BamHⅠ酶切位点，P4/P5引入BclⅠ酶切位点，由美国Verginia大学医学院高斌博士提供。

表1　IL-12引物序列

　　Table 1. PCR primers of human IL-12

Primer Sequence bp
P1 GC GGATCC ATG TGT CAC CAG CAG
P2 AT GGATCC CTA ACT GCA GGG CAC P1P2 for IL-12 P40(1003bp)
P3 GGA TCC AGT GCC TGC CCA GCT P3P2 for IL-12 P40(417bp)
P4 AT TGATCA ATG TGT CCA GCG CGC AGC
P5 GC TGATCA TTA GGA AGC ATT CAG ATA P4P5 for IL-12 P35(676bp)
P6 GAA TTC GAC ACC TCT TTC ATA P6P5 for IL-12 P35(351bp)
　

　　主要试剂：限制性内切酶BglⅡ、BclⅠ、BamHI、EcoRⅠ、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)、T4 DNA连接酶、MMLV逆转录酶等购自GIBCO公司，IFN-γ、LPS、PDBu(Phorbol-12，13-dibutyrate)等购自Sigma公司，TMF-FH昆虫细胞培养基购自PharMingen公司，IL-12 ELISA试剂盒购自R&D公司。

　　SAC的制备：含A蛋白金黄色葡萄球菌在LB斜面培养基上长成菌苔后，生理盐水洗出，甲醛固定，无菌生理盐水洗涤后，80℃ 1 h杀菌，沉淀用RPMI 1640配成2%浓度，应用终浓度为0.02%。

　　末梢血单个核细胞的分离与刺激：血站抗凝血经淋巴细胞分离液分离出单个核细胞(PBMC)，后者在塑料板中37℃ 1 h后，分离悬浮细胞(PBL)和粘附细胞2种，调细胞浓度1×106/ml。用SAC刺激时终浓度为0.02%，37℃作用24 h，用IFN-γ＋LPS刺激时，先用1 000U/ml IFN-γ预处理16 h，再加LPS 5ng/ml刺激4 h。

　　KB，Raji，K562细胞培养与刺激：3种细胞常规RPMI 1640培养后，调细胞浓度1×106/ml。加终浓度为100nmol/L的PDBu，37℃作用24 h。

　　总RNA提取和RT-PCR反应：收集上述细胞经GIT一步法提取总RNA，MMLV逆转录酶合成cDNA，以其为模板分别扩增P40和P35长链及短链，PCR反应体积为100μl，P40长链(1 003bp)扩增参数为94℃ 1 min、60℃ 1 min、72℃ 2 min，循环30次，其它片段为94℃ 1 min、58℃ 1 min、72℃ 1 min，循环35次，末次延长72℃ 7 min。

　　P40和P35 cDNA序列测定：由上海基康生物技术有限公司完成。

　　IL-12杆状病毒表达载体的构建：P40(1 003bp)cDNA和pAcUW51经BamHⅠ酶切、低溶点琼脂糖回收相应片段，T4 DNA连接酶连接，转化DH5α菌，提取质粒经PCR和EcoRⅠ酶切鉴定，获得的重组质粒命名为pAcUW51/P40。再插入P35 cDNA，分别用BglⅡ酶切pAcUW51/P40，BclⅠ酶切P35 cDNA，回收相应片段，T4 DNA连接酶连接，转化DH5α菌，提取质粒经PCR和EcoRⅠ酶切鉴定