乙脑病毒鼠源单链抗体的构建及表达

　　【 摘要 】　目的　获得乙脑病毒（JEV）鼠源单链抗体基因（ScFv）并使其在E.coli中表达。方法　利用噬菌体表面呈现技术，从抗乙脑病毒杂交瘤细胞2H4中构建噬菌体抗体库，采用双抗体夹心模式对抗体库进行富集及检测。并将所获得的阳性克隆基因插入GST融合表达载体中，构建融合表达克隆，使其在E.coli中获得稳定表达产物。结果　所构建的噬菌体抗体库经3轮的吸附、洗脱及再感染的富集过程后，共检测到7株稳定的具有乙脑抗原结合活性的阳性克隆，对其中的mu2H4-3和mu2H4-36进行了序列测定。经分析，2个克隆的基因序列一致，其重链及轻链分别属于Kabat鼠抗体基因家族中第Ⅰ及κ第Ⅵ亚群。构建为融合表达载体pG51-mu2H4后，此单链抗体mu2H4在E.coli BL21中获得表达，产量约为菌体蛋白的10%。结论　从抗乙脑病毒杂交瘤细胞中克隆并表达了特异单链抗体片段mu2H4，为下一步的人源化改造提供了资料。

The construction and expression of the murine ScFv gene against encephalitis virus

MENG Shufang, YIN Hongzhang, LI Defu, et al.

　　(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, P. R. China)

　　【 Abstract 】　Objective　To obtain the gene of murine ScFv against encephalitis virus (JEV) and to express it in E. coli.Methods　By the phage display technology the antibody library was constructed from hybridoma 2H4 against JEV. It was screened and detected by the Sandwich ELISA with antigen JEV. Then the positive gene fragment was inserted into GST fusion vector pGEX-5X-1 to express in E. coli stably.Results　Through three panning of absorb, elution and reinfection, 7 clones were detected to be positive to JEV. And two of them, mu2H4-3 and mu2H4-36, were sequenced. After homology analysis, the gene sequence of these two clones were found to be identical, the heavy chain and light chain separately belong to Ⅰ and κⅥ subgroups in murine antibody family from Kabat library. The recombinant fusion vector pG51-mu2H4 expressed the product with 57 000 of molecular weight, which takes about 10% of the whole protein in E. coli BL21.Conclusion　The ScFv gene (mu2H4) was cloned from hybridoma 2H4 against JEV and expressed in E. coli. It is potentially important for its humanization in the future.

　　【 Subject words 】　ScFv; Phage display technology; Anti-encephalitis virus

　　乙型脑炎病毒感染引起乙型脑炎，近年来，由于实行计划免疫其发病率有明显降低，但因人口流动，地区偏远等因素，仍时有病例发生。乙脑患者虽可保全生命，但约7%～20%的患者留有神经性后遗症，因此需要寻找有效的治疗方案〔1〕。第四军医大学马文煜教授等研制的具有病毒中和活性的乙型脑炎病毒单克隆抗体在乙脑患者治疗中显示了较好的治疗效果〔2〕。但全抗体分子较大，不易穿透血脑屏障，难以进入脑病变部位，尚不能达到更佳疗效〔3〕；单链抗体由多肽链连接的重链及轻链组成功能单位，具有分子质量小，穿透能力强，半衰期短等优点，因此在疾病治疗中具有一定的应用前景。我们以马文煜教授等的单抗杂交瘤细胞株作为原材料，制备单链抗体ScFv片段，使其在乙脑治疗中有进一步发展。

　　材料与方法

　　细胞株来源：抗乙型脑炎病毒杂交瘤细胞株2H4（第四军医大学免疫教研室制备）。

　　试剂、菌株及质粒：mRNA提取试剂盒，重组噬菌体抗体系统（recombinant phage antibody systerm），包括：mouse ScFv module，expression module及detection module均购自Pharmacia公司。宿主菌BL21，本室保存，TG1，Phamarical公司。M13KO7辅助噬菌体，Promega公司，效价为1011PFU/ml。乙脑单抗MC3，本室制备，蛋白A亲和层析纯化，蛋白含量为2.6mg/ml。

　　抗原结合板的制备：采用双抗体夹心法，MC3单抗15μg/ml，200μl/孔包被，37℃ 1 h后4℃过夜，5%脱脂奶粉PBS封闭，37℃ 1 h，加入1∶20倍稀释的乙型脑炎灭活抗原200μl/孔，37℃ 1 h后，备用。

　　杂交瘤细胞mRNA的提取：根据试剂盒使用说明书操作。用oligo-dT纤维素柱吸附洗脱并纯化胞内mRNA，测定其浓度，浓缩后置于-60℃保存备用。

　　噬菌体抗体基因库的构建、富集及克隆筛选：参照mouse ScFv module说明构建鼠源可变区基因VH及VL及ScFv基因。噬菌体抗体基因库的构建、吸附、洗脱、富集及检测，参照expression module及detection module的使用说明，并稍作改动。培养上清过滤后，加入2ml 20%PEG/2.5mol/L NaCl溶液，冰浴并4℃离心，沉淀用300μl 2×YT重悬后，加入100μl含10%脱脂奶粉的PBS，室温放置15 min，200μl/孔加至抗原结合板中。采用甘氨酸-HCl作为洗脱液，先加入50μl pH5.2的甘氨酸-HCl，37℃ 10 min，弃去液体，再加入50μl pH2.2的甘氨酸-HCl，37℃ 10 min后迅速加入3μl 2mol/L的Tris中和，收集洗脱液，感染处于指数生长期的TG1受体菌。如此进行3轮吸附、洗脱及富集。

　　粗制包涵体的制备、变性及复性：1mmol/L IPTG于37℃诱导表达，收集菌体，冰浴10 min，5 000r/min离心10 min，沉淀用10ml预冷PBS洗涤1次，重悬于5ml PBS中，并加入1mmol/L PMST，250μl 10mg/ml溶菌酶，2μl 25μg/ml DNaseⅠ，颠倒混匀后，冰上放置30 min，-70℃过夜。次日水浴迅速融解沉淀，置于冰上，超声波破碎，4℃ 8 000r/min离心10 min，弃上清。沉淀中加入10ml RIPA(包涵体溶解液)［ 0.1%SDS，1%TritonX-100，1%脱氧胆酸钠，1mmol/L PMSF(苯甲基磺酰氟)于TBS中］洗涤2次，所得沉淀即为粗提包涵体。加入2倍体积的10% SDS变性，反复吹吸至包涵体溶解，迅速加入9倍体积的PBS中稀释，并用0.05% SDS-PBS透析过夜后，换用0.01% SDS-PBS继续透析24 h，测定蛋白浓度并分装保存，为复性的mu2H4。

　　mu2H4对亲本单抗2H4的竞争抑制试验：MC3以15μg/ml包被，加入1∶4倍稀释的乙脑病毒培养上清，37℃ 1 h后，加入复性后的不同浓度的mu2H4与等体积HRP标记的亲本单抗2H4的混合物，37℃ 1 h，OPD显色，同时设抑制阴性对照。按公式计算mu2H4对亲本抗体的抑制率。大于50%时认为存在抑制关系。

　　结果

　　1.mRNA的提取：收集4瓶处于指数生长期的2H4细胞，共获得500μl浓度为7.616μg/ml产物，浓缩后，样品溶于20μl DEPC处理过的双蒸水中，浓度约为133μg/ml。

　　2.鼠源ScFv基因库的构建及表面呈现阳性克隆的获得：以上述mRNA为模板经反转录及扩增后，分别获得约370bp VH及320bp VL基因（见图1中Lane 1、2）。将VH及VL基因混合，加入连接肽引物（linker）及重链和轻链双侧引物后，经2次扩增，获得全长约750bp的鼠源ScFv基因，结果见图1（lane 6、7）。将所得鼠源ScFv基因连接于pCantab5E(pC5E)噬菌粒载体上，构建成噬菌体抗体基因库。经3轮富集后，挑选46个克隆进行检测，共获得8株阳性克隆（表1），分别为mu2H4-3，-16，-19，-28，-35，-36，-37和-42。经SfiⅠ/NotⅠ限制酶切图谱分析，8株阳性克隆中均有750bp插入带。稳定性分析表明，mu2H4-28丢失抗原结合活性，其余7株稳定。