抗恶性疟HRP-Ⅱ单链抗体的制备和初步应用

　　【 摘要 】　目的　对制备的可溶性抗HRP-Ⅱ单链抗体进行初步应用研究。方法　对从抗恶性疟原虫红内期噬菌体抗体库中筛选到的能分泌特异性抗HRP-Ⅱ单链抗体克隆株进行可溶性诱导表达，采用Dipstick-免疫胶体金模型，检测重组HRP-Ⅱ和疟疾患者血样。结果　以该抗体包被的Dipstick层析条能特异性检测重组HRP-Ⅱ抗原，并能与恶性疟患者血样中天然HRP-Ⅱ抗原起阳性反应，最低检测抗原量为1ng/ml，敏感度和特异度分别为 81.8%和85.7%，与抗HRP-Ⅱ单抗3A3相比差异无显著性（P＞0.05）。结论　所研制的抗HRP-Ⅱ单链抗体具有作诊断试剂的潜质。

Production and application of anti-HRPⅡ single chain Fv antibodies of Plasmodium falciparum

XU Weiwen, DONG Wenqi, LI Ming, et al.

　　(Institute of Tropical Diseases, First Military Medical University, Guangzhou 510515, P. R. China)

　　【 Abstract 】　Objective　To produce soluble anti-histidine-rich protein (HRPⅡ) ScFv for immuno-colloidal gold-dipstick test of Plasmodium falciparum.Methods　The detection ability for HRPⅡ of the ScFvs was performed with immuno-colloidal gold-dipstick model.Results　The soluble ScFv antibodies could react not only with recombinant HRPⅡ, but also with the native HRPⅡ in the blood samples from patients infected with P. falciparum. The lowest detection threshold was 1ng/ml. And the sensitivity and specificity were 81.8% and 85.7%, respectively. There is no statistically significant difference compared with that of anti-HRPⅡ McAb (P＞0.05).Conclusion　The ScFvs antibodies may prove to be valuable in developing immunological reagents for malaria diagnosis.

　　【 Subject words 】　Histidine-rich protein; Single chain Fv; Dipstick-immuno-colloidal gold; Plasmodium falciparum

　　富含组氨酸蛋白Ⅱ（histidine rich proteinⅡ，HRP-Ⅱ）是恶性疟原虫感染，特别是急性感染病人血清中存在的一种特异性标志，目前已被证明是恶性疟最好的诊断靶抗原〔1〕。国外已在此基础上建立了ParaSightTM-F和ICT Malaria P.f.TM等新兴的快速疟疾诊断方法，被WHO推荐使用〔2,3〕。但目前市场价格较高，特别是对疟疾流行较为严重的广大发展中国家，而单抗的连续大量制备也尚存在一定的困难。本研究在成功构建抗恶性疟原虫红内期噬菌体抗体库并从中筛选到能分泌特异性抗HRP-Ⅱ单链抗体克隆株的基础上〔4〕，发酵制备了一定量的可溶性抗HRP-Ⅱ单链抗体，采用本研究室胡旭初等〔5〕建立的Dipstick-免疫胶体金模型对疟疾患者血样中的HRP-Ⅱ进行检测。为研制疟疾快速诊断试剂盒奠定基础。

　　材料与方法

　　主要材料和试剂：2×TY-AG，2×TY-A，IPTG(Promega)，胶体金（本室自制）；Millipore超滤系统（Millipore LabscaleTM TFF System，Pellico PLCG 10, 50cm2）；重组恶性疟富含组氨酸蛋白Ⅱ（HRP-Ⅱ）（本室自制）、Dipstick层析条（本室自制）、抗HRP-Ⅱ单抗3A3（本室自制）；疟疾患者血样(采自云南)。

　　抗体的制备、超滤和纯化：从SOBAG-N平皿中挑取PF22号和PF184号克隆（均为从抗恶性疟原虫红内期噬菌体抗体库中筛选到的、能分泌特异性抗HRP-Ⅱ单链抗体的阳性克隆株），接种于5ml 2×YT-AG培养基，30℃、250r/min振荡培养过夜，次日以1%的体积比转种于500ml 2×YT-A培养基中，30℃ 250r/min振荡培养至吸光度值A600＝0.8时，加IPTG使终浓度为0.2mmol/L进行抗体的诱导表达，诱导温度为30℃，诱导时间20 h。8 000r/min离心20 min，分别留取沉淀和上清。沉淀用渗透休克法获取细胞周质腔中的抗体。上清中的抗体用Millipore超滤系统超滤浓缩。饱和硫酸铵分步沉淀法加Sephacryl-S200分子筛过柱初步分离纯化目的抗体。

　　单链抗体的活性测定（Dipstick-免疫胶体金法〔5〕）

　　包被及封闭：用本室自制的Dipstick免疫层析条，用碳酸盐包被缓冲液（pH9.6)稀释抗原（HRP-Ⅱ）和ScFv抗体，使浓度均为1mg/ml，各取3μl在膜上划一条粗细均匀横跨膜的细线，抗原线距吸水纸层0.5cm，抗体线在抗原线下0.5cm。点样后用1%牛血清白蛋白碳酸盐包被缓冲液50μl封闭，自然晾干，剪成4条。

　　抗HRP-Ⅱ单抗的胶体金标记：参见胡旭初方法〔5〕。免疫胶体金可用塑料滴瓶密封于4℃或室温保存。

　　单链抗体的活性测定：将浓度为1μg/ml的抗原（HRP-Ⅱ）溶液作1∶10的连续梯度稀释（1×PBS稀释），在塑料盘的凹井内加入25μl，对照为25μl 1×PBS溶液，把Dipstick条放入皿中，待溶液吸干后，加入25μl免疫胶体金，吸干后用PBS-Tween20(pH7.4) 25μl洗涤。靠近滤纸的阳性对照线显红色，抗体包被线显色为抗原阳性，不显色为抗原阴性，能显色的最高抗原稀释度为最低抗原检出量。

　　稳定性的测定：用ScFv抗体包被并封闭好的Dipstick条用塑料袋密封置于4℃或室温保存，分别于7、15、30 d后与HRP-Ⅱ及血样反应，测定其稳定性。

　　ScFv的初步应用及评价：用ScFv包被的Dipstick条检测疟疾病人的血样（40份），正常人血作阴性对照。以血涂片镜检法为金标准，将结果与本室制备的抗HRP-Ⅱ单抗检测血样的结果比较，以敏感度和特异度等指标作诊断试验的初步评价。

　　结果

　　1.抗HRP-Ⅱ单链抗体的制备：以抗体表达的最优化条件（A600＝0.8，IPTG终浓度0.2mmol/L，诱导温度30℃，诱导时间20 h），对PF22和PF184阳性克隆株进行大量发酵（500ml），分别获取其培养上清、细胞周质和全细胞裂解液中的可溶性单链抗体（图1），培养上清的抗体用Millipore超滤系统〔相对分子质量（Mr）为10×103膜〕超滤，体积由500ml超滤至10ml，浓缩50倍。根据预试结果，我们对大量制备的抗体先用饱和硫酸铵分步沉淀法(50%, 70%)初步分离再经分子筛过柱，最终纯度为42.4%（图2），抗体得率为0.75mg/L培养基。