戊型肝炎病毒线性抗原表位克隆及表达的初步研究

　　【 摘要 】　目的　探讨戊型肝炎病毒线性抗原表位的克隆表达策略。方法　合成HEV ORF3羧基端19个氨基酸编码DNA序列，在序列的5′端加入了两个甘氨酸序列，通过基因扩增载体中的5′GGGG/CCCC非对称粘性末端，实现线性表位序列的首尾串联排列。结果　获得了2mer、4mer、6mer、8mer 4个首尾串联的重复序列；分别克隆到表达载体pQE30中后，在IPTG诱导下主要以包涵体形式表达，其中4mer蛋白占细菌蛋白的21.6%，6mer蛋白占细菌蛋白的13.5%，而含8mer的重组菌不表达目的蛋白，首尾串联后每一个线性表位的两端都存在被梭菌蛋白酶识别的特异序列，表达产物可以被重新酶解成小分子肽，经梭菌蛋白酶消化的表达产物可以检测到一定的抗原反应性。结论　通过首位串联可以实现HEV线性表位较高效的表达。

Cloning and expression a linear epitope from hepatitis E virus

XIA Xiaobing, HUANG Rutong, LI Derong.

　　(Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850, P. R. China)

　　【 Abstract 】　Objective　To develop a biological system methods for the mass production of epitope from hepatitis E virus.Methods　The epitope gene was tandem multimerized to 2-mer, 4-mer, 6-mer and 8-mer. Each of the repeating units in the tandem multimers was connected to neighboring gene by a DNA linker encoding Gly-Arg-Pro at the N-terminal and Pro-Arg-Gly at the C-terminal for the cleavage of multimers by clostripain.Results　The multimer were cloned into the expression vector pQE30 and expressed in E.coli M15 with isopropyl β-D-thiogalatopyranoside induction. The expression multimeric peptides encode by the 4- and 6-mer accumulated intracellularly as inclusion bodies and comprised about 21.6%, 13.5% of the E.coli protein respectively, while the pQE30 vector harboring 8-mer gene failed to express in E.coli. The multimeric peptides expressed were cleaved with clostripain, and the antigen reactivity of monomer epitope was examined by ELISA.Conclusion　High level expression of epitope from HEV could be achieved by tandem repeats.

　　【 Subject words 】　Hepatitis E virus; Linear epitope; Tandem repeats

　　线性表位等小分子肽的相对分子质量小，在工程菌中表达时易受到宿主蛋白酶的降解。尽管进行融合表达能解决产物的降解问题，但由于小分子肽在融合蛋白中所占比例很小，产量较低。 解决方法之一就是进行基因串联表达，用这种方法生产的小分子肽不但产量高，而且易于纯化，尤其对于一些药用小分子肽，如心钠素、血管紧张素酶抑制剂（ACEI）等具有很好的应用前景〔1〕。

　　Yarbough等〔2〕详细分析了HEV的线性抗原表位，利用合成的线性表位检测病人标本，发现ORF3与ORF2羧基端的线性表位的检出率最高，说明其抗原反应性较强。本实验合成了编码HEV ORF3羧基端19个氨基酸的DNA序列，利用构建好的基因首尾串联扩增载体，实现该序列的首尾串联排列与原核表达。本研究也可为其它小分子肽的基因工程表达提供参考。

　　材料与方法

　　菌株与质粒：E.coli JM109、E.coli M15，克隆质粒pBlue-SK（+）、表达质粒pQE30均为本室保存。

　　基因扩增载体的构建：寡核苷酸Ⅰ、Ⅱ加入到T4 DNA 连接酶buffer中，85℃加热5 min，然后缓慢降至4℃，在4℃放置30 min后，加入经BamHⅠ+HindⅢ消化的pBlue-SKⅡ(+)进行连接。

　　含HEV ORF3线性表位序列首尾串联载体的构建：寡核苷酸oligoORF3a与oligoORF3b经过变性后缓慢退火，加入T4 DNA连接酶，反应结束后、再加入经BpiⅠ线性化的扩增载体，连接产物转化E.coli JM109。

　　含HEV ORF3线性表位序列首尾串联表达载体的构建：挑选分别插入了4、6、8个首尾串联体（4mer、6mer、8mer）的阳性重组子，酶切、回收目的片段与pQE31连接。

　　表达产物的酶解：取经过SDS-PAGE纯化的表达产物，加入梭菌蛋白酶，37℃消化3 h。

　　表达蛋白的活性检测：电泳回收产物及其酶解产物直接用ELISA分析；包涵体用透析液悬浮，室温放置30 min，取一部分悬浮液进行酶解，12 000×g 15 min离心，非酶解上清与酶解上清物皆用ELISA分析； ELISA方法参考文献〔3〕。

　　结果

　　1.扩增载体的构建：合成了2条寡核苷酸，其中oligoⅠ含有一个BpiⅠ位点及一个BamHⅠ粘性末端，oligoⅡ含有一个反向的BpiⅠ位点及1个HindⅢ的粘性末端，在连接酶buffer中退火形成：5′GATCC(GAAGACCC)GGGGCCGTCTTCA；GCTTCTGGGCCCC(GGCAGAAG)TTCGA5′，可以克隆到经BamHⅠ及HindⅢ消化的pBblue-SKⅡ(+)中，形成扩增载体pBpiⅠ。经BpiⅠ酶切后，在新载体上可以产生由4个碱基组成的非对称粘性末端5′GGGG/CCCC，该粘性末端可以用来扩增外源DNA片段，实现基因的首尾串连。

　　2.含HEV ORF3线性表位序列首尾串联多聚体的构建：位于HEV ORF3羧基端19个氨基酸的线性表位序列为R-P-S-A-P-P-L-P-H-V-V-D-L-P-Q-L-G-P-R，考虑到原核表达的需要，根据E.coli的偏性密码子合成了一对互补的63mer的寡核苷酸序列，退火后可以形成非对称粘性末端5′GGGG/CCCC5′，用于插入经BpiⅠ消化的pBpiⅠ中，也利于自身连接形成首尾串联。我们在该序列中还设计了梭菌蛋白酶识别位点（梭菌蛋白酶特异性识别Pro、Gly、Arg 3个连续残基中Gly-Arg组成的肽键〔2〕）；即合成的DNA片段除编码HEV ORF3羧基端的19个氨基酸的线性表位外，还编码由2个甘氨酸组成的linker，该linker与线性表位N-端的Pro-Arg残基相连，由于线性表位C-端的氨基酸残基为Arg-Pro，因此实现首尾相连后，每一个线性表位的N-端及C-端都含有梭菌蛋白酶特异性识别位点。

　　寡核苷酸序列退火后进行自身连接，回收2mer，与经BpiⅠ消化的pBpiⅠ连接。用T7与T3启动子序列通用测序引物进行PCR扩增，鉴定出插入了线性表位2mer的阳性克隆质粒pBpiⅠ-2mer。取扩增产物经BpiⅠ酶切后进行自身连接，再与经BpiⅠ消化的pBpiⅠ连接。最后我们挑选到了分别插入了含线性表位四聚体（4mer）、六聚体（6mer）、八聚体（8mer）的克隆质粒（pBpiⅠ-4mer、pBpiⅠ-6mer、pBpiⅠ-8mer）。

　　3.首尾串联序列的表达及其产物的SDS-PAGE鉴定：将线性表位序列首尾串联体克隆到pQE30载体中连接，转化受体菌E.coli M15。分别用IPTG进行诱导。SDS-PAGE结果表明，在含有4mer及6mer的重组菌中都能观察到目的蛋白的表达，相对分子质量(Mr)分别为14×103、16×103左右，分别达到细菌蛋白的21.6%、13.5%，而含8mer的重组菌中不表达目的蛋白（图1）。收集菌体并进行超声破菌，对超声后上清以及沉淀进行SDS-PAGE分析，结果表明两种表达产物均主要以包涵体形式存在于胞内