乙肝病毒特异性核酶的构建及体外切割活性的初步研究

　　设计针对HBV复制中间体mRNA的核酶，用于抗病毒治疗是国内外的一个研究方向。利用重组PCR技术合成了核酸基因(简称RZ)，并克隆于T7启动子下游，进行了体外转录及切割活性的研究。

　　以重组引物P13(+)、P14(-)(每条引物的5'端为结合序列，3'端为催化序列，两引物3'端为9个碱基完全互补)PCR合成RZ，经琼脂糖凝胶电泳纯化后，用T载体克隆，另外设计一引物P13(+)(载体T7启动子上游)，与P14(-)配对，用于筛选正向插入T7启动子下游的阳性克隆(简称pRZ)，并进行序列测定。以引物DT3(+)和DT4(-)扩增乙肝病毒C基因片段并克隆，以HindⅢ酶切筛选正向插入于T7启动子下游的阳性克隆(简称pBVCF),并进一步测序。将pRZ、pBVCF用BamHⅠ完全酶切，加入KlenowⅠ继续保温30分钟，琼脂糖电泳纯化线性的pRZ、pBVCF,定量后拟做转录模板。pRZ进行非标记大量转录，pBVCF进行α-32P标记转录，反应条件参照试剂盒说明，转录产物分别称为rRZ,rBVCF。rRZ经酚、氯仿/异戊醇抽提后乙醇沉淀。rBVCF经PAGE后在自显影带处切下长1厘米宽5厘米的胶条。4℃浸泡在NES缓冲液中过夜，酚、氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀。10μl的切割反应体系(0.1mol/L Tris- HCl,pH8.0，20mmol/L MgCl2)中加入纯化的rRZ和rBV各2μl，分别于37℃、42℃、55℃保温1小时。PAGE，放射自显影。

　　结果(1)RZ的序列为5'AACATTGACATAGCTCTGATGAGTC　CGTGAGGACGAAACTACTAATTCCCTGGA3'，与设计完全相符，插入方向一致。(2)BVCF方向一致，序列与文献报道基本一致，并且拟切割的位点2156～2158的GTC完全正确：(3)切割反应选择了接近体内环境的低离子强度及金离子，在37℃时，有切割活性；随着温度升高，活性增强。本工作为进一步选择合适的载体，运用于体内切割活性的研究提供了基础