帕金森病猴模型纹状体多巴胺转运蛋白和多巴胺D2受体显像的比较研究

　　【摘要】　目的　观察偏侧帕金森病（PD）猴模型纹状体多巴胺转运蛋白（DAT）和多巴胺D2受体（D2R）功能变化，探讨DAT和D2R在PD诊断方面的临床意义。方法　利用DAT配体99mTc-TRODAT-1【2β-N，N-双（2-硫乙基）乙撑二胺基，3β-（4氯苯基）托烷】和D2R配体131I-IBZM、131I-AIBZM【4-氨基-N-（1-乙基-2-四氢吡咯基）甲基-5-碘-2-甲氧基苯甲酰胺】、单光子发射体层摄影术（SPECT）显像观察MPTP制备的偏侧PD猴模型纹状体的DAT和D2R功能变化，并进行131I-IBZM【左旋-2-羟基-6-甲氧基-N-（1-乙基-2-吡咯烷）甲基苯酰胺】放射自显影观察。高效液相色谱-电化学法检测离体尾、壳核及黑质多巴胺（DA）及其代谢产物浓度。HE染色光镜观察黑质纹状体的病理改变。结果　DAT SPECT显像可见偏侧PD猴模型MPTP损毁侧纹状体的99mTc-TRODAT-1放射性浓集缺失，D2R SPECT显像则发现MPTP损毁侧与未损毁侧纹状体的131I-IBZM和131I-AIBZM放射性浓集无明显差别。放射自显影进一步证实了D2R SPECT显像结果。生化和病理改变证实模型猴制备成功，且与DAT SPECT显像结果相一致。结论　偏侧PD猴模型纹状体的DAT变化早于D2R，DAT SPECT显像有助于对PD的早期诊断和病情监测。

Comparative imaging study of striatal dopamine transporter and dopamine D2 receptor in MPTP-induced hemiparkinsonian monkeys

CHEN Shengdi　LIU Zhenguo, WENG Zhongfang,et al.

　　Department of Neurology, Ruijin Hospital,Clinic and Research Center for Parkinson Disease, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025， China

　　【Abstract】　Objective　To evaluate the clinical practice of dopamine transporter (DAT) and dopamine D2 receptor (D2R) for the diagnosis of Parkinson′s disease (PD)by measuring the activities of striatal DAT and D2R of hemiparkinsonian monkeys.Methods　DAT and D2R imagings were performed by single photon emission computed tomography (SPECT) with　99mTc-TRODAT-1 and　131I-IBZM, 　131I-AIBZM respectively in MPTP-induced hemiparkinsonian monkey models with no apomorphine(APO)-induced rotational behavior. The brain tissue sections were imaged by autoradiography with　131I-IBZM. The levels of dopamine (DA) and its metabolites were measured by high performance liquid chromatography and electrochemical detection (HPLC-ECD). The histopathology was observed by microscopy and hematoxylin and eosin(HE) stain.Results　The reduced uptake of　99mTc-TRODAT-1 in MPTP-lesioned striatum was found by SPECT, as compared with that in intact one, but no difference of　131I-IBZM,　131I-AIBZM uptake was noted between the bilateral striata. The finding of autoradiography was in accordance with that of SPECT scanning with 　131I-IBZM and　131I-IBZM. The neurochemical and neuropathological changes in hemiparkinsonian monkey model paralleled that of SPECT imaging with　99mTc-TRODAT-1.Conclusion　The change of DAT is earlier than that of D2R in the hemiparkinsonian monkey model with no APO-induced rotational behavior. The SPECT imaging of striatal DAT is helpful for the early diagnosis of PD and for monitoring the progression of the disease.

　　【Key words】　Parkinson disease;Carrier proteins;Receptors, dopamine D2; Tomography, emission-computedSingle-photon

　　帕金森病（Parkinson disease,PD）的特征性病理改变是中脑黑质多巴胺(DA)能神经元变性，受其支配的纹状体DA含量显著降低，产生运动减少、肌僵直、震颤、姿势障碍等临床症状。由于黑质DA能神经元变性，纹状体部位的突触前膜多巴胺转运蛋白（dopamine transporter, DAT)及突触后膜多巴胺D2受体(dopamine D2 receptor, D2R)都会发生相应的改变。DAT和D2R是反映DA能神经系统病变的2个重要指标，对PD的早期诊断、病情监测、疗效观察起着重要作用［1，2］。本文选用DAT的显像剂99mTc-TRODAT-1【2β-N，N-双(2-硫乙基)乙撑二胺基，3β-(4氯苯基)托烷】、D2R的显像剂131I-IBZM【左旋-2-羟基-6-甲氧基-N-(1-乙基-2-吡咯烷)甲基苯酰胺】、131I-AIBZM【4-氨基-N-(1-乙基-2-四氢吡咯基)甲基-5-碘-2-甲氧基苯甲酰胺】，运用单光子发射体层摄影术(SPECT)在体检测偏侧PD猴模型的DAT和D2R功能变化，探讨和比较DAT和D2R变化的临床意义。

　　材料和方法

　　1. 偏侧PD猴模型： 正常雄性恒河猴2只（M1和M2），年龄8岁和10岁，体重8.0～9.5 kg，均为经右侧颈总动脉注射神经毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP，剂量：0.7 mg/kg体重)产生PD样左侧肢体强直、运动减少等症状，其中阿朴吗啡（APO）未诱发出旋转，处死前亦未诱发出旋转。

　　2. DAT 和D2R配体标记:(1)99mTc-TRODAT-1标记：根据Meegalla等［3］ 的方法合成并标记99mTc-TRODAT-1，标记率及放化纯度均大于90％；（2）131I-IBZM和131I-AIBZM标记［4］：采用氯胺T法标记131I-IBZM和131I-AIBZM，标记率＞85%，放化纯度＞95%。

　　3. PD猴模型DAT和D2R SPECT显像：于MPTP注射后不同时间进行SPECT显像（表1），M1进行3次显像，其中99mTc-TRODAT-1 DAT显像2次，131I-AIBZM D2R显像1次；M2显像2次，先后为99mTc-TRODAT-1 DAT显像及131I-IBZM D2R显像。动物在氯胺酮诱导麻醉下，进一步以氯胺酮及安定维持麻醉，于注射显像剂1～2 h前用KClO4封闭甲状腺及脉络丛。将猴仰卧固定于检查床上，头保持不动，OM线垂直地面。静脉注射放射性配体（99mTc-TRODAT-1、131I-AIBZM和131I-IBZM）后于不同时间(30 min、1 h、2 h、4 h)行断层扫描。采用低（99mTc）或高（131I）能高分辨率准直器，矩阵64×64，双探头绕头颅旋转180°，单探头绕头颅旋转360°，能峰40 kev（99mTc）和364 kev（131I），窗宽20%。采集结束后经计算机自动处理，重建脑断层图像，于注射后2 h选取清晰图像进行分析。在纹状体（ST）、额叶（FC）、颞叶（TC）及枕叶（OC）部位设定相同形状面积（圆形5.0 mm2）的区域作为感兴趣区（ROI），自动计算ROI放射计数，代表DAT或D2R的密度或功能状态。

　　4.131I-IBZM放射自显影： 猴M2接受131I-IBZM 1.4 mCi 注射2 h，SPECT显像清晰可见左、右侧纹状体放射性浓集分布后,将其迅速断头,取出全脑，干冰冷冻,经5%～7%羧甲基纤维素钠包埋固定，冰冻切片，片厚40 μm，选取经纹状体部位，左、右侧形态相一致的组织切片6～10张，将其紧贴于G-250自显像仪扫屏，显像曝光4 h，图像分析系统对两侧纹状体及各脑叶皮层进行光灰度测定，取其平均值并计算纹状体与各皮层测定值的比值。

　　5. 生化检测及病理观察： 猴M1于注射MPTP后4个月，行SPECT显像2个月后处死，取两侧尾核、壳核和黑质组织，匀浆后经高效液相色谱-电化学法（HPLC-ECD）检测DA及其代谢产物，同时留取部分组织进行HE染色光镜观察。

　　结果

　　1.99mTc-TRODAT-1 DAT SPECT显像：静脉注射1～2 h后，99mTc-TRODAT-1在纹状体区有高度放射性浓集，额叶、枕叶及颞叶皮质有轻度浓集。断层显像ROI LST／RST比值在1.10～1.22之间，图像显示左、右侧纹状体放射计数明显差别，左侧大于右侧（图1）。从表1中可见猴M1 ROIs ST／FC、ST／TC、ST／OC的比值，左侧明显高于右侧。表明PD猴模型右侧纹状体DAT功能下降，而且,在APO未能诱发出旋转行为也有明显改变。

　　2.131I-IBZM、131I-AIBZM D2R SPECT显像：注射131I-IBZM或131I-AIBZM后30 min、1 h、2 h及4 h的横断位扫描图像中，左、右侧纹状体放射性计数及左、右侧纹状体与额叶、颞叶及枕叶的比值基本相同，无明显变化（图2）。表明MPTP一侧颈内动脉注射后，APO未诱发出旋转的模型猴其D2R无明显变化。

表1　PD猴M1、2 DAT和D2R配体SPECT显像ROIs

　　放射性计数比值

猴 MPTP

　　(d)
 配基量

　　(mCi)
 LST/RST ST/FC ST/TC ST/OC
R L R L R L
M1 60
 10.0*
 1.22 1.20 1.50 1.04 1.27 1.18 1.52
　 72 24.0* 1.19 1.10 1.28 1.04 1.18 1.18 1.35
　 102 2.0△ 1.02 1.38 1.45 1.39 1.46 1.49 1.51
M2 7 20.0* 1.12 1.23 1.39 1.15 1.48 1.32 1.50
　 14 1.4△ 1.00 1.30 1.29 1.33 1.31 1.27 1.27

　　ST：纹状体；　FC：额叶；　TC：颞叶；　OC：枕叶；　R：右侧；L：左侧； *：99mTc-TRODAT-1；　△：131I-IBZM　　3. 猴M2131I-IBZM放射自显影:猴M2脑冠状位放射自显影图像可见壳核、尾核、黑质、伏隔核及嗅结节有131I-IBZM放射性浓集。壳核、尾核、额叶及颞叶ROI灰度值在MPTP损毁侧（右侧）与未损毁侧（左侧）之间无差别，与SPECT在体检测结果相一致。

　　4. 猴M1 DA及其代谢产物含量: 猴M1注射MPTP侧的DA、二羟苯乙酸（DOPAC）和3-甲氧-4-羟基苯乙酸（HVA）浓度，尾核分别减少98.9%、95.7%和81.8%；壳核分别减少99.1%、97.4%和87.9%；黑质分别减少81.4%、42.3%和64.5%，MPTP损毁侧黑质、纹状体DA含量已显著降低，符合PD的生化改变，表明模型制备成功。

　　5. HE染色观察：猴M1脑组织HE染色光镜下可见MPTP注射侧的黑质及尾、壳核部位神经细胞数目明显减少，残留神经元变性，部分细胞胞浆明显肿胀，空泡变性，或神经元固缩坏死，可见噬神经细胞现象，伴轻度胶质细胞增生。表明M1的病理符合PD模型的改变。

　　讨论

　　PD是一种常见的中老年人神经系统变性疾病，根据其典型的锥体外系肌僵直、震颤及运动减少等临床症状，以及对左旋多巴制剂反应效果佳，且单侧肢体首先起病的特点，对PD的诊断并不困难。但该诊断是一种症状性诊断，并非是特异性病理诊断，尽管有些临床指标的敏感性可达99%，但病理诊断的特异性不超过75%［5］。

　　PD通常隐袭起病，当黑质DA能神经元缺失达50%以上，纹状体，尤其壳核DA含量降低80%以上时，患者才出现临床症状［6］。在出现临床症状之前，即亚临床期，根据常规检查很难诊断。PD治疗的方向在于亚临床期进行有效的保护性治疗。因此，如何在PD亚临床期及时、正确作出诊断是保护性治疗的必要前提。

　　DA能神经元突触前膜DAT和突触后膜D2R的功能变化是反映DA能神经系统病变的二项客观指标。本实验利用神经毒物MPTP制备的偏侧PD猴（APO未诱发旋转行为），采用SPECT显像方法比较了同一模型猴DAT和D2R不同时间的功能变化，发现MPTP未损毁侧纹状体可见DAT配体99mTc-TRODAT-1放射性浓集，而损毁侧浓集缺失，未损毁侧/损毁侧纹状体放射活性比值为1.12～1.22，SPECT图像可见两侧明显差别。虽然，模型猴（M1）APO未诱发出旋转行为，但病理和生化改变已证实该模型制备成功。表明MPTP损毁侧DAT功能缺失，间接反映黑质DA能神经元缺失。同时，也发现未损毁侧（左侧）和损毁侧（右侧）纹状体均有D2R配体131I-AIBZM的放射性浓集，左、右侧纹状体放射性比值约为1.0。猴M2放射自显影结果进一步证实了D2R SPECT显像结果，提示APO未诱发出旋转的偏侧PD猴模型，其两侧D2R功能无明显变化。以上结果表明，DAT功能变化比D2R功能变化更早、更直接，与临床观察结果相一致［2,7］。

　　以往我们观察了MPTP制备的偏侧PD猴模型不同时间的生化改变，发现注射MPTP后第7天，其损毁侧纹状体及黑质DA及其代谢产物含量比未损毁侧降低60%左右，而注射后4个月，其生化改变降低达99%以上，病理检查也进一步得到证实［8］，认为注射MPTP第7天左右的PD猴模型可以模拟PD患者的早期改变。本实验猴M2为注射MPTP第7天进行DAT SPECT显像，可以发现其损毁侧DAT功能降低，而其第14天时D2R功能无变化，表明DAT比D2R对PD早期诊断更敏感。

　　在PD猴模型显像的前提下，我们也观察了MPTP不同程度损毁的C57BL小鼠的DAT和D2R的功能变化，发现随损毁程度的加重，DAT功能逐渐下降，而D2R功能在损毁轻时，呈上调趋势，而损毁严重时则下降。表明DAT比D2R更适用于对PD的病情监测。