促进着床成功的一类生物大分子--糖结合物在着床中的作用

　　生殖生物学研究表明，着床是一个极其复杂的、程序化的过程。胚泡接触、粘附并植入子宫内膜，受到多方面因素调节。现认为，胚泡与子宫内膜双方必须同时分化到一段特定时间，着床才可以成功。子宫内膜受到性激素、细胞因子等因素调节，达到具有接受胚泡的能力，同时来源于胚泡的滋养层，发育到具有浸润性状态，着床可以成功，这段关键时期，被称为“着床窗口”（implantation window），小鼠大约持续24h，人类大约持续6~7d[1]。状闲期间，胚泡与子宫内膜接触，使接触部位局部内膜上皮降解，然后胚泡粘附与内膜上皮，最后由于滋养层的浸润作用，在24h内，胚泡植入子宫，并开始形成具有多功能性质器官——胎盘。曾经认为促使胚泡与子宫内膜初次接触是整合素分子（integrin）,但研究表明它们仅分布于内膜上皮连接侧面及基底部，而分布于与胚泡接触的内膜上皮顶端较少，所以，它们只有在胚泡与内膜上皮接触之后才发挥粘附作用。细胞生化方法发现，子宫内膜表达大量的糖结合物，在着床前期子宫内膜表面糖结合物[主要是多糖-蛋白复合物（glycocalyx）]厚度减少，但有4种糖基表达增加，也有2种糖结合物浓度下降，这些糖结合物被认为是子宫内膜在敏感期，接受性时期，不反应期的分子标志。同样在着床期音质胚泡表面，也发现有糖结合物表达增加[2]。这些糖结合物被认为是调节胚泡与内膜在正确的时间和部位发生初次接触的重要调节因子。本综述将主要围绕围着床期间的糖结合物对胚泡着床的作用展开探讨。

　　一、围着床期间主要糖基结构

　　糖结合物指糖同蛋白质或脂类共价结合而成的糖蛋白，蛋白聚糖，糖脂，脂多糖一类化合物。出现子宫内膜和胚泡表面的主要是寡糖链、糖蛋白、蛋白聚糖等糖结合物。在这些多糖-蛋白复合物中，认为其中糖基在着床过程中发挥主要作用。这些糖基主要是以Galβ1-GlcNAc为基本骨架结构的寡糖链[3]。它们有的发生了双岩藻糖化；有的发生了单岩藻糖化；也有未发生岩藻糖化[4]。以Galβ1-GlcNAc为基本单位，糖可以分为二种类型：一种是以Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3结构为主的Ⅰ型乳糖；另一种是以Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-3结构为连接形式的Ⅱ型新乳糖，这些基本结构再进一步组装成线状或分支链，然后以N-糖苷键形式连接到蛋白质上，形成糖蛋白，蛋白多糖，在胚泡与内膜接触中发挥着重要作用[3]（见附表）。

附表 常见糖基结构

名称 结构 单抗
LNF-Ⅰ Fucal-2Galβ1-3GlcNAcβ1- 667/9E9
LNF-Ⅱ Fucal-2Galβ1-4GlcNAcβ1- 647/9A2
LNF-Ⅲ Galβ1-4[Fucal-3]GlcNAcβ1- 630/7H1
Ley  Fucal-2Galβ1-4[Fucal-3]GlcNAcβ1- 672/7E3
Ley Fucal-2Galβ1-3[Fucal-4]GlcNAcβ1- H001
LNT Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc 619/1D2
血型A Gala1-3[Fucal-2]Galβ1-3/4GlcNAc A003/5
血型B GalNAca1-3[Fucal-2]Galβ1-3/4GlcNAc B005/6

　　Kimber(1988年)，运用单克隆抗体技术，分析了大鼠子宫内以Galβ1-3（4）GlcNAc为基本结构的寡糖，并发现几种在子宫内膜上皮表达的岩藻化寡糖结构，而基质中未发现[4]。Murphy（1991年）运用生化方法发现大鼠妊娠第6d，围着床期间的子宫内膜有4种基本糖基结构表达增加，葡糖胺三糖（glucosamine trisaccharides）、半乳糖胺（galactosamine）、岩藻糖（fucose）、葡糖胺单糖（glucosamine monosaccharides）四种糖基，它们都是糖基的基本组成成份[5]。Stein（1994年）运用同样的方法，在妊娠5d的大鼠胚泡表面发现葡糖胺三糖这种糖基也表达增加[6]。这些研究表明围着床期间，内膜和胚泡表面的寡糖链、多糖蛋白复合物可能是调节内膜和胚泡表面初次接触的分子机制。它们的变化，可能受到卵巢分泌的性激素调节[8]。

　　二、雌、孕激素对糖基表达的影响

　　在内膜上皮表达的岩藻化寡糖结构对母体性激素反应是不同的，其中一类受到性激素调节，另一类受到性激素影响较小，如子宫内膜上皮持续表达的寡糖结构-血型抗原A、B。雌激素主要负责控制子宫的接受性[2]，能够刺激某些糖蛋白的合成，在小鼠动物模型发现，能优先刺激生成N-糖苷键乳糖胺蛋白多糖的合成。然而孕激素能降低细胞表面的糖基和某些特异糖蛋白的表达，但它也能刺激某些特异糖蛋白的表达，但它也能刺激某些糖蛋白的生物合成，如Gp42、Gp24、Gp58[7]。

　　着床期间，卵巢性激素通过调节子宫内膜和胚泡表面的糖结合物，尤其是糖基部分，从而可以影响着床[3]。小鼠动物实验表明，子宫能够接受胚泡着床，先受到围着床期间的雌激素高峰调节，再暴露于持续，低含量的孕酮，之后24h时间内，允许胚泡着床。此时的子宫内膜对来自胚泡的信号是有反应的[8]，而非孕子宫内膜对胚泡信号及胚泡粘附于内膜是没有反应的，这主要与雌激素调节有关。运用卵巢切除加激素替代治疗，发现在孕激素作用下，胚泡状床延迟，但是当注射雌激素之后，胚泡着床延迟，但是当注射雌激素之后，胚泡可被重新激活，并可以着床，这与着床期间有一过性的雌激素水平升高的事实相符，并且观察到孕/雌激素比值决定了糖基最适宜的表达，对于保证着床成功的必要的[8]。

　　三、糖结合物介导胚泡着床作用机制

　　糖结合物中的糖基通过多方面机制，使胚泡粘附于内膜，目前认为主要通过以下几种途径：①寡糖链与相应配基结合，直接发挥粘附作用。②寡糖链对胚泡接触内膜有一定抑制作用，对着床起到负调控作用，着床期间，它的表达必须下降。③糖结合物通过局部免疫调节作用，促使胚泡着床。

　　（一）寡糖与相应配基结合使胚泡粘附于内膜

　　1.Ⅰ型H抗原（LNF-Ⅰ，lacto-N-fucopertarose1）

　　Kimber（1988年）运用单抗技术，发现双岩藻糖化寡糖结构及单岩藻化寡糖LNFⅢ，在妊娠3d小鼠的子宫内膜腔上皮，但妊娠4d时，荧光色度降低，妊娠5d时荧光仅限于6~50个细胞区域。雌激素可刺激LNF-Ⅰ表达增加，而孕激素无此效果[4]。

　　Lindenberg(1988年)把从牛乳中提取的具有LNF-Ⅰ结构的乳糖，注射到小鼠宫腔内时，其胚泡状床能力显著下降，说明宫膜中游率LNF-Ⅰ寡糖有阻止胚泡与子宫内膜接触的作用，其有效浓度是0.1~1mmol/L，并且还具有抑制滋养外胚层的生长作用[9]。着床被阻碍原因，光镜和电镜切片显示胚泡与内膜接触部分未见形态学差异[8]。可能是内膜表达的LNF-Ⅰ可与在滋养层表面分布的LNF-Ⅰ的受体结合，从而使胚泡与内膜可以接触，但当宫腔中有游离的LNF-Ⅰ，它与内膜上LNF-Ⅰ竞争，占据了滋养层表面的LNF-Ⅰ受体，使该受体失去了与内膜LNF-Ⅰ结合的能力，从而影响着床[10]。至于Kimber（1988年）发现小鼠妊娠3~5d时，LNF-Ⅰ荧光染色降低，是因为小鼠胚泡在妊娠第4d着床，内膜表面LNF-Ⅰ已与滋养层表面受体结合，能与单抗667/9E9结合能力降低，所以染色变弱；另一方面，也与激素调节有关，在妊娠3~5d之后，子宫内膜将暴露于持续的孕激素，它可以抑制LNF-Ⅰ寡糖表达下降[4]。

　　2．Ley

　　Ley糖是Ⅱ型岩藻化寡糖，在月经期、早期妊娠的子宫内膜腺上皮和腔上皮以及围着床期间的胚泡表面、滋养外胚层和内细胞团均可以检测到。内膜腔上皮表达的Ley受性激素影响较小，内膜腺上皮表达的Ley受孕激素的负调节。Zhu（1995年）研究认为，以Ley为基本结构的糖链对着床有重要作用[11]，在妊娠第4d子宫内注射Ley的单抗可以阻碍着床。这是一个剂量信赖性和时期牧民性阻碍过程，当抗体尝试在8μg/20μl时，可以阻碍着床，当大于8μg/20μl时时，反而不受影响；另外在小鼠交配后87~93h后，注射抗体，可以特异地阻碍着床过程，在其他时间，则不受影响。着床被阻碍的原因，不是由于子宫内膜上皮出现形态学变化，抗体对胚泡也没有毒性，而是单抗阻碍Ley与其配基结合，从而抑制着床；也可能封闭了子宫内生长因子结合部位；或者抑制了滋养外胚层细胞迁移和分化。但Ley的配基现在还不十分清楚，不过在脂质体中发现Ley可与H1、H2抗原结合。

　　3．子宫凝集素（uterine agglutinin,UA）

　　在宫腔内有与刀豆素A（ConA）有高度亲和力且富含甘露糖糖蛋白/血凝素的化合物，它的糖基除含有甘露糖，还有N-乙酰葡糖胺、半乳糖。现在，被命名为UA，UA包含甘露糖-6-受体，而M-6-P受体有许多生物功能，Das（1994年）认为UA对胚泡着床也有重要功能，可能通过如下两方面的作用机制[12]：①着床期间胚泡表面表达ConA受体，而子宫内膜的UA含有ConA样/甘露糖结合样部位，与其结合，指导胚泡接触着床部位。②UA与M-6-P有高度亲和力，具有M-6-P受体的功能，其中最显著一方面能结合生长因；如转化生长因子（TGFβ）前体包含M-6-P，研究中也发现，子宫基质和蜕膜胞外基质有TGFβ聚集，UA可通过其M-6-P受体样作用，结合带有M-6-P结构的生长因子，调节胚泡的生长发育，促胚泡与内膜相互接触。

　　4．载脂蛋白J（apolipoprotein j,apoJ）

　　子宫内膜可以产生结合脂类的双亲性糖蛋白apoJ，它是一种膜表面活性分子，大约是80Kda，由二硫锓联接不同两个亚单位组成[13]。在人类月经分泌晚期，apoJ出现在腺上皮表面[14]。它在腺上皮和腔上皮的表达时间是不同的。ApoJ信使核糖核酸（mRNA）最早在性交后5.0d出现[15]。在围着床期间，腺上皮所表达apoJ mRNA在着床前期即可测及，并一直持续到着床后期，腔上皮也表达apoJ，但围绕着床部位的腔上皮并不表达。apoJ蛋白在非蜕膜化组织出现，而蜕膜细胞并不表达。

　　apoJ被诱导产生，主要有两方面因素，一是围着床期间，激素调节所致，当注射雌激素后，再注射孕激素，可诱导apoJ表达，而长期注射孕激素并未引起变化[14]。另一因素是因月经周期和胚泡植入内膜，可引起组织损伤，当组织重建时可诱导产生[13]。apoJ被认为是子宫具有接受性分子标志，对着床还有促进作用。apoJ能与胞外基质的纤维联结蛋白，肝素结合，可使胚泡接触内膜，同时，腺上皮和腔上皮可以提供给胚泡apoJ连接样脂质然后依此脂质，胚泡可以与内膜上的apoJ结合。另外作为膜表面活性分子的apoJ，还具有蛋白酶样活性，破坏细胞和胞外基质，对胚泡植入内膜也有一定作用。

　　5．硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan surfate proteoglycan,HSPG）

　　HSPG属于糖结合物中的蛋白多糖类[15]，而硫酸乙酰肝素（heparan surfate，HS）属于糖胺聚糖。Carson（1993年）研究认为胚泡与子宫内膜上皮细胞表面的HSPG能使胚泡粘附于内膜并刺激胚泡生长。在围着床期间，胚泡表面的HSPG表达增加，然而当子宫内膜具有接受性时，HSPG表达下降，这与着床期间的雌激素调节有关。

　　因胚泡表面有大量HSPG，与表达在子宫内膜HS受体相互作用，使胚泡与内膜相互接触，粘附。HSPG的糖基部位——多聚寡糖，对碱性纤维生长因子（basic fGF,bFGF）高度亲和力，属于酷氨酸蛋白激酶受体，在着床部位可测及bFGF，这样它可与滋养层表面HSPG相互作用，对滋养层细胞生长，分化，浸润有一定作用。

　　（二）对着床起负调控作用糖蛋白

　　1． 粘蛋白-1（mucin-1,Muc-1）

　　粘性糖蛋白家族之一的Muc-1认为与着床密切相关[6]，是子宫非孕状态分子标志。Muc-1是一种膜内在糖蛋白，最早从乳腺癌细胞中分离克隆出来的。Muc-1表达仅限于内膜腺上皮和腔上皮，在月经增殖期间含量较低，在分泌早、中期升高，之后又降低；在围着床期间，内膜上皮Muc-1表达下降，认为内膜上皮顶端的Muc-1抑制胚泡与内膜接触，起到抗粘附作用，过高表达的Muc-1抑制了细胞与细胞、细胞与胞外基质粘附，保持子宫的非接受性状态；另外Muc-1能有效抑制降解酶活性，从而间接抑制细胞间接触和浸润[17]。

　　2． 唾液粘蛋白复合体（sialomucin complex,SMC）

　　最近研究表明，SMC有抵抗胚泡状床的功能，也是子宫非孕状态的分子标志。SMC是异源二聚体组成的膜表面糖蛋白，包含粘蛋白的亚单位ASGP-1和穿膜蛋白ASGP-2。与Muc-不同的是，内膜上皮中的SMC有可溶形式和膜结合形式两种形式存在，雌激素可刺激其表达增加，而孕激素则降低SMC的表达。动物试验表明，大鼠交配后1～4d，SMC表达逐渐下降，在5～6d时，其下降更为明显，而大鼠交配的5～6d正是着床窗口开启期间，子宫内膜具有接收性，其阻碍胚泡着床的机制目前还不清楚[8]。

　　（三）局部免疫调节的糖蛋白

　　1. 触珠蛋白样糖蛋白（haptoglobin-like glycoprotein）

　　Anderson（1986年）发现妊娠4d的小鼠，内膜上皮表达出几种糖蛋白，具有一定的周期特异性，他以分子量命名这些糖蛋白，分别是Gp24、Gp38、Gp42、Gp58，这些是由孕激素刺激产生的[7]。最近Gp42引起学者们广泛注意，该蛋白分泌产物N端13个氨基酸与触珠蛋白β亚基相似。触珠蛋白是由2个α及2个β亚单位组成的蛋白质，由肝脏分泌的，属于急性期反应蛋白[19]。这些结果提示GP42可能是触珠样蛋白多肽复合体的一个亚单位，功能似触珠蛋白，在炎症和损伤时，大量释放入血液中。触珠蛋白样糖蛋白可与淋巴细胞或中性粒细胞受本结合，能减少这些细胞的非特异性激活，具有一定免疫抑制功能。现已知哺乳动物的着床部位有单个核细胞浸润，而且还有免疫调节的介质存在，组胺、前列腺素、血小板激活因子。所以，着床过程中，Gp42是作为抗微生物因子或者调节炎症及免疫反应因子而促使着床成功。

　　2.半乳糖苷结合样凝集素（β-galactoside-binding lectin）

　　以往的研究中发现β-半乳糖结合样蛋白出现于鼠类和人类子宫和胎盘中，它们属于S-乳糖血凝素（也称为galectins）[20]。有两种S-乳糖血凝素认为与着床有关，一种是Galectin1,14Kda糖蛋白，胚泡期便在滋养层细胞表面表达，在子宫上皮及其他各层组织中也有表达，然而它的表达随妊娠进展未见有任何变化，在子宫及胎盘表达呈均一相。另一种是Galectin3,30Kda糖蛋白，在非孕子宫未见其表达，然而在围着床期间，蜕膜基底层，子宫腺上皮，滋养层表面都有表达。

　　在体外Galectin 1起到生长因子样作用，可引起血管平滑肌和肺内皮细胞增殖。Galectin3对细胞也具有增殖作用，一方面它在核内和胞浆内以磷酸化蛋白存在，与信号转导有关；另一方面N段功能哉与HnRNA（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,HnRNA）相似，表明它在DNA转录翻译中对mRNA有加工和修饰作用。两种Galectin对多聚-N-乙酰乳糖胺有较高亲和性，而胞外基质中层粘边蛋白、纤维联结蛋白出现这种糖基，所以可使胚泡与内膜发生接触。Galectin3能与不同分化抗原标志的淋巴细胞结合，对组织中巨噬细胞、嗜碱性细胞、肥大细胞浸润有重要调节作用。尽管对着订部位最为丰富的细胞-NK细胞功能，目前还不十分清楚，但Galectin3对NK细胞的定位及调节其免疫功能有一定的作用。

　　四、辅助生殖技术与糖结合物

　　当前，针对许多不孕患者，采用了体外受精-胚胎移植（IVF-ET）等辅助生殖技术，尽管应用了促性腺激素（hMG、hCG），使一次周期可以排多个卵泡，但成功妊娠的比例并没有较大提高。Kramer（1994年）运用植物血凝素-抗生物素蛋白-生物素-铁蛋白（lectinavidin-biotin-ferritin）的生化方法研究促排卵激素是否影响糖基表达。发现使用促排卵药后，在大鼠妊娠5.5d时，内膜细胞表面顶端多糖复合物显著减少，主要包括以α-L-岩藻糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺为基本结构的糖基减少[21]。Peverini(1995年)等运用类似方法，发现围着床期间大鼠内膜表达增加的葡糖胺三糖，当应用促排卵激素之后，表达也降低。形态学观察，未用此药，孕鼠内膜较平，绒毛粗钝，但应用此药后，内膜绒毛较长，可能也是影响着床的因素这一[22]。

　　使用促排卵激素虽然能排出多个卵泡，但妊娠率并未相应提高，一个重要原因是它降低了子宫内膜的接受性，胚泡状床难度增大。子宫接受能力降低，可能由多方面因素决定：内膜形态改变，另外与4种糖基表达下降有关。但究其原因，可能是促排卵激素改变了孕/雌激素的比例，从而影响了糖结合物表达。

　　综上所述，糖基在极其复杂的着床过程中，发挥着重要作用，它的主要功能是使胚泡与内膜相互识别，初次接触，为以后粘附分子进一步发挥粘附作用及滋养层浸润作准备。参与初次接触过程其它分子如细胞因子CSF-1、IL-1β、HB-EGF和少量粘附分子（αvβ3）也有一定作用，但如果封闭了糖基，也影响胚泡着床，说明糖基对着床作用不可忽视。所以，深入研究糖结合物，了解着床期间宫腔内环境及子宫内膜在不同状态时期的分子标志，对今后不孕症的病因研究和治疗，提高辅助生殖技术的妊娠率以及开展计划生育工作将具有重要意义。

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