荧光标记mRNA差异显示技术

 　　摘要 目的：应用荧光标记的mBNA差异显示技术。方法：提 取未经过／经过IFN、LPS处理的三组人单核细胞系U937的总RNA并以此为模板，采用荧光标 记的锚定引物，通过逆转录、差异显示PCR反应，经5．6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差 异条带，回收后将其再扩增。结果：三组样本的 DD-PCR产物电泳显示长30 0 bp～2.0 kb不等的扩增片段，条带清晰、明亮，背景低，各样本相互间的差异不仅呈有 无的变化，亦表现出很多强弱改变；再扩增条带锐利、单一。结论：在本试 验室成功应用了荧光标记差异显示技术，可快速、敏感、经济有效地筛选各种未知的表达基 因。

　　中图分类号：　Q781文献标识码： B

　　文章编号：1000-6834(200 0)04-0373-04

FLUORESCENT mRNA DIFFERENTIAL DISPLAY TECHNIQUE

WANG Gang-shi

　　（Department of Gastroenterology General Hospital of Chinese PLA , Beijing 100853;）

　　WANG Meng-wei

　　（Department of Gastroenterology General Hospital of Chinese PLA , Beijing 100853;）

　　YOU Wei-di

　　（Department of Gastroenterology General Hospital of Chinese PLA , Beijing 100853;）

　　WANG Hong-fan g

　　（ Institute of Zoology,Chinese Academy of Science, Beijing 100080）

　　FENG Mei-fu

　　（ Institute of Zoology,Chinese Academy of Science, Beijing 100080）

　　ABSTRACT　　Aim: To apply fluorescent mRNA differential display technique.Met hods: Total RNA samples were extracted from human monocyte line U937 treat cd/untreated with IFN and LPS, and were used as templates in differential displa y PCR. The anchored primers used were labeled with the fluorescent tag. After ru nning on 5.6% denaturing PAGE gel, differentially expressed bands were excised a nd recovered, and finally reamplified. Results: Three tested samples all showed amplified bands differed from 300 bp to 2.0 kb, the bands were brigh t and clear, the background was low. Both yes/no changes and upregulated/downreg ulated happenings were shown simultaneously. The reamplification bands were shar p and pure. Conclusion: We have successfully practiced fluorescent differential display technique in our lab. It is a fast, safe and cost-effecti ve method used to sereen unknown expressed genes.

　　KEY WORDS:　differential display;　RNA;　messenger ;　fluorescence

　　mRNA差异显示技术(differential display，DD)是用于研究基因的差异表达的新方法。该技术自1992年［1］]被首次报道后，即以其不可替代的优势被广泛应用于生物医学 领域。在应用过程中不断得到改进［2］，并产生了诸多衍生技术如RPA(RNA finger printing by arbitrarily primed PCR)、GDD(genomic DD)等。本文简要介绍在本试验室荧 光标记差异显示技术(fluorescent DD，FDD)的应用及体会。

　　1　材料与方法

　　1．1　标本

　　人单核细胞系U937，细胞密度2×108/L，分对照组(N)、处理Ⅰ组(T1)、处理Ⅱ组(T 2)，N用1640培养基及10％胎牛血清培养，T1用IFN-γ104U/L LPS 1μg/L、T2用IFN- γ10 U/L LPS l0μg/L分别刺激7 h。

　　1．2　主要试剂与仪器

　　TRIzol试剂(GIBCO BRL)、Fluoro DD试剂盒(Genomyx)、Supersript Ⅱ逆转录酶(GIBCO 　BRL)、Ampli　Taq DNA聚合酶(GIBCO BRL)、RNase-free DNaseI(Promega);Genomyx LR 、 Genomyx SC、DNAThermal Cycler(Perkin Elmer)

　　1．3　总RNA的制备

　　按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总 RNA，以 RNase-free DNase I(终浓度80 000 U/L)除去其中污染的 DNA，经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以紫外分光光度计检 测其纯度

　　1．4　mRNA差异显示

　　1.4．1　逆转录反应　选择锚定引物［T7(dT12)AP(anchored prime rs，AP)，序列为5′ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3′，其中 M＝A／G／C． N＝A /G/C/T］，以总RNA为模板进行逆转录反应，每管反应体系如下：总RNA l．0μg,AP 4 pmol ,70℃ 5 min,加入50 mmol/L Tris-HCl(pH8.3),75 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl2,10mmol /L DTT,25μmol/L，dNTPmix(1∶1∶1∶1)，SuperScriptⅡ 60 Units，总反应体系20 μl 。42℃ 5 min，50℃ 50 min，70℃ 15 min。

　　1．4．2　荧光标记差异显示PCR　 选取与逆转录引物序列相同的带荧光物 质标记的锚定引物［TMR-T7(dT12)AP］，随机引物(5'ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG 3')，以逆转录产物为模板，进行PCR反应。反应体系包括：20 mmol/L Tris-HCl(pH8．4) ，50 mmol/L KCl，3．75 mmol/L MgCl2，逆转录产物3．0 μl，50 μ mol/L dNTP mi x(1∶1∶1)，0．35 μmol/L 5'-随机引物,0．35 μmol/L 3-锚定引物,Ampli Taq 0.5 U nits，总反应体系10 μl。95℃ 2 min。94℃　15 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，4个循环； 94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min，25个循环；72℃延伸7 min。

　　1．4．3　分离差异显示片段　配制5．6％变性聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0．2 5 mm，大小61×33 cm。将PCR产物加4．0 μl上样缓冲液，95℃变性后上样。3000V、100 W 、55℃电泳4．5 h。干胶后置于Genomyx SC扫描，用系统所带的AcquireSC program软件分 析处理扫描结果。

　　1．4．4　回收差异条带　用AcquireSC软件将差异条带定位，用一次性手 术刀片切割下所需条带，置于30 μl去离子水中，37℃水浴30～60 min，备用。

　　1．4．5　差异条带的再扩增　以经上述处理的回收条带为模板，T7启动子 22-mer(5'GTAATACGACTCACTATAGGGC3')、反M13(-48)24-mer(5’AGCGGATAACAATTTCACACA GGA3')为引物,进行再扩增反应：模板2.0 μl,20 mmol/L Tris-HCl(pH8．4)，50 mmol/L KCl，1．5 mmol/L MgCl2,20 μmol／L dNTP mix(1∶1∶1∶1)，0．2 μmol／L T7、0 ．2 μmol/L M13-r，AmpliTaq 1．0 U nits，总反应体系20 μl。反应条件同差异显示PC R。

　　2　结果

　　2．1　总RNA的质量

　　总RNA经Dnase I处理，用1．0％甲醛变性凝胶电泳，可见清楚的28 S、18 S、5 S条带 ，且28 S／18 S约为2∶1(图1)，表明RNA完整性好，无降解现象。N、T1、T2的OD260／OD28 0比值分别为1．92、1．83、1．98，表明样品纯度高。

　　基因表达是调节细胞生物学行为的核心。探讨处于不同生理、病理状态下的有机体之间 的未知表达基因的差异，是研究生命本质的有效途径。1992年报道的真核细胞mRNA差异显示 技术［1］，为检测未知的表达基因提供了一种新的途径。DD技术具有快速、敏感、 可同时检测两组或以上的组织或细胞、RNA用量少、可检测某一表达基因的有无或其表达的 强弱等优点，一经问世即受到许多领域的重视并得以广泛应用。然而，该技术也存在着一些 缺陷，主要表现为：cDNA产物的质量较低，在序列胶中往往呈不清晰状态［2］；所 得的cDNA片段通常小于500 nt，往往是3'-端的非翻译(编码)序列；所得差异片段的假阳性 高，可高达85%［3］等。

　　荧光标记差异显示技术通过对引物设计、PCR条件、凝胶、电泳条件以及标记物的改进，极 大减少了上述不足。

　　差异显示的锚定引物有单碱基锚定引物、简并或非简并的双碱基锚定引物等多种类型，本实验通过使用双碱基锚定引物，将总mRNA群体分为12个亚群，这极大减小了每一锚定引物 产生的第一条cDNA链的数量，不仅可降低随机引物的用量，更可降低DD产物的复杂性，使差 示条带在序列胶上易于分辨，从而传统方法中常见的“重叠带”现象减少。DD专用的随机引 物的特点为A+T与G+C含量近乎相等，且3’-端以G或C结尾，可增加DD扩增的效率。通过改 变RT-PCR反应条件如底物浓度、延伸时间等，差异片段的长度可达1．0～1．5 kb(图2)， 因较长的cDNA片段容易通过Northern blot进行分析鉴定辨别真假阳性克隆，且其中可提供 更多的序列信息，故获取大的片段具有重要的意义。

　　文献认为差异显示居高不下的假阳性率实际上因再扩增所致［4］。通常， 再扩 增的引物与DD引物相同，本试验将再扩增引物设计为T7(22-mer)与M13-r(24-mer)，此为 在锚定引物的5’端和随机引物的3'端分别增加的序列(本文方法中所列差异显示引物序列的 划线部分)，这两种来源于原核生物的引物尽可能降低了在真核mRNA序列中非特异性扩增的 机会。同时，T7启动子序列可直接用于体外转录合成cRNA探针，为cDNA片段的直接测序和鉴 定(RPA或Northern分析)提供了方便。

　　用常规的序列分析胶进行分辨时,较长的cDNA片段往往挤在胶的上端而影响分辨率。本 操作改用5．6％的PAGE胶(聚丙烯酰胺)，减少胶的厚度(仅250 μm)，通过提高电泳的电压( 3000 V)及温度(55℃),可显著提高分辨率。

　　同位素标记存在曝光时间长、带型不佳，基本与相邻的带混合、污染等缺点，将荧光物 质标记于锚定引物的5'端,可产生清晰、明亮、低背景的分辨效果，操作周期仅两天。

　　目前，DD技术己被广泛应用于与疾病、衰老、生殖、生长发育、分化等生理［5］ 、病理过程相关的未知表达基因的研究,相信对揭示生物界基因表达调控的奥秘将起重要的 作用。

　　军队“九五”医药卫生科研基金资助课题(96M145)

　　作者简介：王刚石（1968-），男，安徽歙县人，主治医师，博士 ，主要从事消化系统疾病的临床与基础研究。

　　4　参考文献

　　［1］ Liang P， Pardee A B. Differntial display of eukaryotic messenger RNA by means of the Polymerase Chain Reaction ［J］. Science，1992,257:967 -971.

　　［2］ Shoham N G. Arad T, Rosin-Abersfeld R, et al. Differential display as say and analysis ［J］. Biotechniques,1996,20(2):182-184.

　　［3］ Zegzouti H. Improved screening of cDNAs generated by mRNA differential di splay enables the selection of true positives and the isolation of weakly expres sed messages［J］. Plant molecular Biology Reporter， 1997,15:236-245.

　　［4］ Miele G. MacRae L, McBride D, et al. Elimination of false positives ge nerated through PCR reamplification of differential display cDNA［J］.Biotec hniques,1998,25(1):138-144.

　　［5］ Cirelli C, Tononi G. Differences in brain gene expresion between sleep and waking as revealed by mRNA differential display and cDNA microarray technolog y［J］. J Sleep Res,1999,8(Suppl)1:44-52