亚低温减少沙土鼠脑缺血后延迟性神经元死亡机制的研究

　　摘要 目的：研究亚低温对脑缺血后延迟性神经元死亡的影响及其与海马羟自由基产 生及纹状体多巴胺和ATP含量变化的关系。方法：沙土鼠前脑缺血再灌注 模型，缺血10 min,应用病理检查方法判断海马CAl锥体细胞死亡的数目。动物随机分为假手术组、缺血组、缺血再灌注组和亚低温缺血再灌注组。高效液相加电化学检测器方法测定海 马羟自由基和纹状体多巴胺的含量，高效液相紫外检测器法测定纹状体ATP含量。 结果：亚低温条件下沙土鼠海马CA1区锥体细胞的死亡数目明显减少，海马2，3- DHBA的含量明显低于缺血再灌注组(P＜0．01)，纹状体多巴胺和ATP含量均明显高于 缺血再灌注组(P＜0．01)。结论：低温可减少脑缺血后延迟性神经元死 亡的数目，其机制可能与其减少脑缺血再灌注期间海马羟自由基产生和纹状体多巴胺释放及 促进纹状ATP含量恢复有关。

　　中图分类号： R743.3；R971；R977.3 文献标识码：A

　　文章编号：1000-8634（2000）04-0365-05

THE STUDY OF MECHANISM BY WHICH MILD

　　HYPOTHERMIA REDUCED DELAYED NEURONAL DEATH

　　AFTER CEREBRAL ISCHEMIA IN GERBILS

CHEN Qun　ZENG Yin-ming　WANG Shi-lei　XU Peng-cheng　FAN Jian-wei

　　（Department of anesthesiology, Jiangsu Province Key Laboratory of anesthesiology, affiliated hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002）

　　ABSTRACT　Aim: To study the effect of mild hypothermia on delayed neuronal death a s well as the relationship between hydroxyl radicals generation in hippocampus a nd the change of dopamine and ATP content in striatum following ischemia/reperfu sion in gerbils. Me-thods: The ischemia was induced by occl usion the both carotid common arteries for 10 minutes in gerbils. Animals were divided into fo ur groups: sham-operated group, ischemic group, ischemia/reperfusion group and mild hypothermic ischemia/reperfusin group. The numbers of delayed neuronal deat h were assessed by histological examination. OH． outputs in hippocampus and dop amine content in striatum were specifically identified and quantitated by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled with electrochemical detection (ECD). ATP content in striatum was also determined by HPLC. Results: Mild hypothermia significantly reduced the numbers of damaged neurons in hippo campus CA1 subfield after ischemia in gerbils. In MH group, 2,3-DHBA outputs we re much less than that in IR group (P＜0.01). Dopamine and ATP content in st riatum were higher than those in IR group (P＜0.01). Conclusion: Mild hypothermia could decrease the delayed neuronal death in gerbils by reducin g hydroxyl radicals production in hippocampus and inhibiting dopamine release as well as prompting the recovery of ATP content in striatum following ischemia/re p erfusion in gerbils.

　　KEY WORDS：　ischemia;　DND;　hippocampus;　striatum ;

　　短暂前脑缺血后，海马CA1区的锥体细胞发生延迟性神经元死亡(delayed neuronal death， DND)。大量研究表明，缺血再灌注损伤与氧自由基，特别是羟自由基(OH．)产生有密切关系 。脑细胞因富含不饱和脂肪酸和 Fe2+，更易遭受氧自由基的攻击而损伤，但至今对 脑缺血再灌注期间氧自由基的来源尚不清楚。已有研究报道，儿茶酚胺通过氧化脱氨基作用 可生成氧自由基［2］。多巴胺为纹状体内主要的儿茶酚胺，而脑缺血可引起纹状体 内中小型细 胞内多巴胺大量释放至细胞外。因此，脑缺血所致的纹状体内多巴胺释放可能为氧自由基的 来源之一。亚低温为减轻脑缺血再灌注损伤的有效方法之一，它可减轻脑缺血再灌注期间的 脂质过氧化反应，但亚低温对脑缺血再灌注期间纹状体内多巴胺含量变化的影响尚少见报道 。纹状体细胞内多巴胺含量的维持与ATP的供应密切相关，而脑缺血可直接影响脑细胞的能 量供应。本实验旨在探讨亚低温对脑缺血后沙土鼠海马 CA1区锥体细胞延迟性死亡、羟自 由基产生以及纹状体多巴胺和 ATP含量变化的影响，并揭示他们之间的关系，为阐明亚低温 减轻脑缺血再灌注损伤的机制提供新的依据。

　　1　材料与方法

　　1.1　动物模型

　　实验采用沙土鼠，50～60 g，雌雄各半。腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥钠麻醉，仔细分 离双侧颈总动脉并用无创动脉夹阻断造成前脑缺血，10 min后松开动脉夹恢复脑血流即为再 灌注。监测 EEG判断脑缺血的完全程度，凡双侧颈总动脉阻断1 min后，EEG不成等电位的沙土鼠，均从实验中剔除。

　　1．2　动物分组

　　生化指标测定分为假手术组(sham-operatedgroup，SH)、缺血组(ischemic group，IS )、缺血再灌注组(ischemia/reperfusion group，IR)和亚低温缺血再灌注组(mild hypothe rmia ischemia／reperfusion group，MH)(每组n=8)。沙土鼠分别在脑缺血10 min、再 灌注60 min时断头处死，生理盐水冰面上分取纹状体、海马，液氮冷冻后，-75℃冰箱保存 待测。病理检查分为 SH、IR和MH三组(每组n=6),在脑缺血后7 d灌注处死行病理检查。

　　1．3　脑温及控制

　　因鼓膜温度与脑温最为接近［3］，故本实验将热敏电极直接插入沙土鼠耳内监 测鼓膜温度以反映脑温。将动物置于流动空气浴箱内，应用白炽灯泡升温或冰袋降温的方 法控制沙土鼠脑温于预定值。SH、IS、IR组生化指标测定的动物在整个实验期间脑温均控制 在(37±0．2)℃，MH组脑缺血期间沙土鼠脑温控制在(37±0．2)℃，再灌注期间脑温控制 在(32±0．2)℃。SH和 IR组行病理检查的动物脑温控制同前，MH组再灌注期间亚低温(32 ±0．2)℃时间持续6 h，然后脑温升至(37±0．2)℃持续7 d。

　　1.4　海马羟自由基含量(OH．)的测定

　　采用 Kil［4］等的测定方法，应用水杨酸捕捉OH．，通过高效液相和电化 学 检测器测定2,3-二羟基苯甲酸(2，3-DHBA)和2，5-二羟基苯甲酸(2，5-DHBA)的含量。 水杨酸钠100 mg/kg在动物处死前30 min由腹腔注射。测定时，海马组织称重后以1∶3(W／V )加入3％高氯酸，在冰浴下用超声波匀浆器制成匀浆，9000　g离心15　min，4℃。上清夜1 0 μl注入高效液相(varian 5000)电化学检测器(L-ECD-6A型)系统测定 OH．的含量。色 谱柱为15 cm×4 cm Lichrosorb-RP-18;氧化电位+0．75 mV。流动相:0．03 mol/L柠檬 酸、0.03　mol/L醋酸钠缓冲液，pH 3．6，流速1 ml／min。

　　1．5　纹状体多巴胺含量的测定

　　应用高效液相加电化学检测器的方法［5］。纹状体称重后，0．1 mol/L高氯酸 匀浆，15 000 g离心15 min，4℃，然后取上清夜10 μl进样。电化学检测器电压+0．75 mV。流动相：0．1 mol/L柠檬酸，0．1 mol/L乙酸钠，EDTA 5 mg/L，辛烷磺酸钠230 mg/L( pH 3.5)，流速1 ml／min。

　　1.6　纹状体ATP含量的测定

　　应用高效液相加紫外检测器测定方法［6］。纹状体称重，加冷0．4 mmol／L的 高氯酸成10％匀浆，1 500 g，低温离心15 min。取上清夜0．4 ml，用 K2CO3调 pH至 中性，4℃，3 000 g离心5 min，取上清夜10 μl进样。色谱柱，ODS-C18；流动相 ，0．1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)，流速1 ml/min。紫外检测器波长254 nm。

　　1．7　病理检查

　　在脑缺血后第7 d，沙土鼠再次戊巴比妥钠麻醉，经主动脉插管灌注生理盐水20 ml继以 4％福尔马林100 ml，然后断头取脑，4％福尔马林浸泡固定，在囟门后 1.7 mm处石腊切片 ，厚5 μm。高倍镜下观察海马 CA1区内细胞膜和核膜完整，核仁清楚的存活锥体细胞数目 ［1］。

　　1．8　统计学处理

　　数据以均数±标准差 (±s)表示，应用组间t检验进行统计学处理。

　　2　结果

　　2．1　亚低温对海马CA1区锥体细胞DND的影响

　　假手术组可见 CA1区锥体细胞排列整齐紧密，细胞核大而圆，有1～2个明显的核仁(图1 )。缺血再灌注组海马CA1区锥体细胞明显减少，可见较多凝固性坏死的细胞碎片，罕见核 膜完整，核仁清楚的锥体细胞(图2)。亚低温组仍可见到较多核膜完整，核仁清楚的锥体细 胞，但数量明显少于假手术组(图3)。