人La多肽融合蛋白在E.coli中的表达

www.cnkang.com 2007-3-20 16:14:00 中华康网

　　摘要: 目的　构建在E.coli中表达人La多肽的质粒。方法　以人脾cDNA为模板,通过PCR获得La多肽(全长)的DNA片段。将此片段利用双酶切定向克隆到MBP(麦芽糖结合蛋白)融合系统的载体pMALTM-c中，表达可溶性融合蛋白，并通过亲和层析予以纯化。结果　免疫印迹实验(IBT)证明, 表达的融合蛋白具有La抗原多肽的特异性,而敏感性超过生化制备的ENA制品。结论　重组融合蛋白与天然ENA制品存在免疫学同一性。

　　中图号 : Q55　文献标识码：A　文章编号： 1007－8738(2000)03－0207－04

Cloning and expression of a fusion protein with human La polypeptide in E.coli

ZHAO Xiao-yu　LIU Jian-rong　JING Tian-yu　WANG Hui-wen　WANG Yan-fang　WANG Xi-ming

　　（Institute of Biotechnology, Hebei University, Baoding 071002, Hebei Province, China ）

　　Abstract: Aim To construct a vector expressing human La polypeptide in E.coli. Methods The full length DNA fragment encoding La polypeptide was obtained by PCR from human spleen cDNA. The La DNA fragment was cloned into plasmid pMAL c(a maltose binding protein, MBP fusion vector) and expressed in E.coli. The soluble MBP La fusion proteins were purified by affinity chromatography using amylose resin. Results Western blot showed that the fusion protein could react with anti La antibody as the natural La polypeptide, and the sensitivity was higher than natural antigen. Conclusion The fusion La polypeptide has the immunoidentity with natural La polypeptide. length DNA fragment encoding La polypeptide was obtained by PCR from human spleen cDNA. The La DNA fragment was cloned into plasmid pMAL c(a maltose binding protein, MBP fusion vector) and expressed in E.coli. The soluble MBP La fusion proteins were purified by affinity chromatography using amylose resin. Results Western blot showed that the fusion protein could react with anti La antibody as the natural La polypeptide, and the sensitivity was higher than natural antigen. Conclusion The fusion La polypeptide has the immunoidentity with natural La polypeptide.

　　Kaywords:La antigen;PCR; cloning; expression; fusion protein ▲

　　La(又名SSB)抗原是存在于哺乳动物细胞核中的一种小核RNA/蛋白质复合物(smallnuclearribonucleoproteincomlexes,snRNP)，即LaRNP。它是由相对分子质量(Mr)为47000的多肽(磷蛋白)与小核RNA组成〔1〕。这些小核RNA包括7SRNA，5SRNA和tRNA前体，以及某些病毒RNA(如:VARNA和EBERRNA〔2，3〕)。La抗原作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止因子,在基因调控中起重要作用〔4〕。临床上干燥综合症(Sjogren'ssyndrome)和系统性红斑狼疮(SLE)等患者体内往往存在抗La抗体，通常利用含有La抗原的可提取性核抗原(ENA)制品检测患者体内的抗La抗体,可为临床鉴别与诊断上述疾病提供依据〔5〕。

　　实验证明，La抗原的抗原决定簇在La多肽上〔7，8〕。我们根据文献报道的编码La多肽的DNA序列〔1〕设计引物,通过PCR扩增获得编码La多肽的特异性DNA片段。将该片段克隆到pMALTM-c表达载体中，在大肠杆菌中以麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的的形式得到表达，并通过亲和层析获得纯化。

　　1　材料和方法

　　1.1材料载体pMALTMc，amyloseresin和兔抗MBP抗血清，为NewEnglandBiolabs公司产品。IPTG，Xgal和T4连接酶，为Promega公司产品。人脾QuickCloneTMcDNA为Clontech公司产品。DH5α和BL21来自中科院生物物理所。PVDF膜为Gelman公司产品。抗La抗体阳性血清来自天津长征医院免疫室。引物由上海生工生物有限公司合成。HRP－羊抗人IgG和HRP－羊抗兔IgG，购于北京生物制品研究所。人脾和猪脾ENA为河北大学生物工程公司产品。

　　1.2方法

　　1.2.1La质粒的构建我们所用载体pMALTMc(简称pc)为麦芽糖结合蛋白(MBP)融合系统。依据人La多肽编码序列〔1〕设计一对引物,以人脾cDNA为模板进行扩增获得DNA片段。选择pc的多克隆位点(polylinker)中EcoRI和SalI两个酶切位点作为外源DNA的插入点，通过T4DNA连接酶将该片段与pc定向连接,并转化到DH5α受体菌中,在含有IPTG和Xgal的培养基上筛选白色重组子。

　　1.2.2免疫印迹实验(IBT)样品经100g/LSDSPAGE电泳后,用Minitransblotelectrophoretictransfercell(BIORAD)电转移到PVDF膜上,以50g/L脱脂奶粉封闭。然后相继与抗血清(一抗)、HRP－羊抗人IgG或HRP－羊抗兔IgG(二抗)反应,DBT显色。

　　1.2.3DNA序列测定以pMALTMc系统malE的正、反向引物,对阳性克隆质粒的插入片段进行DNA序列分析(北京赛百盛公司产品)。

　　1.2.4La多肽融合蛋白的纯化菌体经超声破碎、抽提后，取上清液通过amyloseresin柱，用10mmol/L麦芽糖洗脱。收集洗脱物置低温保存。

　　1.2.5亲和层析纯化抗体将人脾ENA包被在PVDF膜上，与抗La抗体阳性血清反应后，用甘氨酸洗脱，经1mol/LTris盐中和后，低温保存。

　　2　结果

　　2.1La多肽编码DNA片段的扩增根据文献〔1〕报道,本实验设计的PCR引物为：SN:5′GCCGTAATGGCTGAAAATGG3′;ASN:5′CGAAGTGGACCTAATTCGG3′,其中5′端分别加上EcoRI和SalI酶切位点。按此设计要求扩增片段的长度应该为1342bp。以人脾cDNA为模板,利用上述引物进行扩增,扩增条件为:首先94℃变性1min;然后94℃0s，48℃2s，72℃30s，30个循环后,72℃再延伸1min。扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳后,显示出1条长度约为1.4kb的DNA片段