人CD19基因在痘苗系统中的表达

www.cnkang.com 2007-3-20 16:16:00 中华康网

　　摘要：目的　在痘苗系统中表达人CD19基因，为研究CD19分子的结构、功能及研制抗CD19的单克隆抗体 (mAb)打下基础。方法　用 PCR技术扩增人CD19全长基因，并重组入克隆载体pGEM T，进行序列测定。将CD19全长基因克隆入痘苗表达载体pJSA1175中，用脂质体介导的方法，与野生病毒共转染TK－143细胞。运用蓝斑筛选获得含人CD19全长基因的重组痘苗病毒，并用此重组病毒感染 TK－143细胞，以 APAAP法检测人CD19基因在真核细胞中的表达。结果　含人 CD19基因的重组痘苗病毒可表达在TK－143真核细胞的表面。结论　人CD19全长基因在痘苗系统中成功地得到表达。

　　中图号 : Q786　文献标识码：A　文章编号：1007－8738(2000)03－0200－05

Expression of human CD19 in vaccinia virus expression system

Guo Yan-xiang　Hu Mei-ru　Shu Cui-ling　Hong Hai-yan　Shen Bei-fen

　　（Department of Molecular Immunology， Institute of Basic Medical Sciences， Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China）

　　Abstract: Aim To express CD19 gene in vaccinia virus expression system and lay the foundation for preparing anti CD19 mAb and investigating its structure function relationship. Methods A fragment of CD19 gene obtained by PCR was inserted into pGEM T and sequenced. Recombinant vaccinia virus was obtained by transfecting TK－ 143 cells with pJSA1175 CD19 plasmid in the presence of infectious TK＋ vaccinia virus. APAAP method was used to detect the expression of CD19. Results The recombinant vaccinia virus bearing CD19 gene was found to express on the surface of TK－ 143 cells. Conclusion The full length CD19 gene in vaccinia virus system was successfully expressed.

　　Keywords: human CD19; vaccinia virus; gene expression ▲

　　CD19分子是B细胞表面相对分子质量(Mr)为95000的糖基化I型跨膜蛋白，仅表达于正常造血系统的B细胞和生发中心的滤泡树突状细胞(FDC)。CD19分子的表达在骨髓B祖细胞即开始，持续于整个B细胞成熟期，直至分化为浆细胞时消失〔1－4〕。CD19/CD21/CD81复合物与BCR形成B细胞的双重抗原结合模型，参与B细胞的信号转导〔8－10〕。另外，CD19分子可参与B细胞内Ca2＋的移动，调节B细胞的活化与增殖〔5〕，还可通过mIgM的信号放大参与B1淋巴细胞的发育和再生〔6〕。研究发现，CD19分子还特异表达于B系恶性细胞中。国外曾利用抗CD19mAb的导向作用，与毒素连接形成免疫毒素，治疗白血病及淋巴瘤。本研究旨在痘苗系统中表达人CD19基因，以为抗CD19mAb的研制及对其结构、功能的研究奠定基础。

　　1　材料和方法

　　1.1材料所用工具酶分别购自Promega公司和Gibco公司。DNA纯化试剂盒，购自Clontech公司。BuDr及Xgal购自Sigma公司。Lipofectin和MEM培养基，购自Gibco公司。重组质粒pUC19CD19，表达载体质粒pJSA1175和菌种Mc1061，由本室保存。pGEM-T-EASY载体试剂盒，购自Promega公司。TK－143细胞由本室保存，用含100mL/LFCS的MEM培养，培养液中含有250mg/L的Budr。

　　1.2方法

　　1.2.1DNA重组技术参照文献〔11，12〕中的有关章节。

　　1.2.2DNA序列测定采用T7启动子和SP6启动子作为上、下游引物，用本室ABI373A型DNA自动测序仪进行序列测定。

　　1.2.3共转染用(0.05～0.1)pfu/细胞的野生痘苗病毒量，感染50％～90％贴壁的TK－143细胞。病毒感染的总体积为1mL。于37℃感染1.5h，每15min摇动培养瓶1次，使病毒充分吸附于细胞。期间制备质脂体－DNA混合液(参见GibcoLipofectin使用说明书进行质粒转染)。1.5h后移出病毒液，用无血清MEM培养基洗细胞3次，逐滴加入质脂体DNA混合液，轻轻转动培养瓶，使混合液均匀分布。于37℃培养4h～5h后，补加5mL含40mL/L小牛血清的MEM完全培养基，于37℃继续培养48h。连瓶一起反复冻融3次，以释放病毒，收集全部培养液作为病毒原液。

　　1.2.4病毒感染将病毒原液用含20mL/L小牛血清的MEM完全培养基做4次对数稀释。每个稀释度取1mL感染50％～90％贴壁的TK－143细胞，于37℃感染1.5h，每15min摇动培养瓶1次，使病毒充分吸附细胞。补加4mL含20mL/L小牛血清的MEM完全培养基，于37℃继续培养48h。然后，以结晶紫染色计数蚀斑或铺琼脂凝胶进行蓝斑筛选。

　　1.2.5蓝斑筛选重组病毒病毒感染细胞48h后，去掉培养液，铺加营养琼脂(20mL/L小牛血清、10g/L琼脂糖和200mg/LXgal，融于MEM培养基中)。待琼脂糖凝固后反转培养瓶，37℃继续培养6～24h，观察病毒蚀斑的颜色变化，用前端弯曲的平头滴管挑取蓝斑，放于1mL含20mL/L小牛血清的MEM完全培养基中。反复冻融3次后，取0.5mL感染50％～90％贴壁的TK－143细胞。病毒感染48h后，倒掉培养液，铺加营养琼脂挑取蓝斑，如此反复3次以上，直到感染的细胞瓶中出现的病毒蚀斑达100％为蓝斑为止。

　　1.2.6结晶紫染色计数蚀斑病毒感染48h后的细胞，倒掉培养液，加1mL结晶紫染液(结晶紫1g，甲醇80mL和蒸馏水700mL)，室温放置5min后，用自来水冲去浮色计数蚀斑。

　　1.2.7表达蛋白的检测收集检测细胞，用PBS洗两次后离心甩片，自然吹干、丙酮固定10min，吹干。滴加抗CD19mAb(1∶50)15μL，室温作用30min后，用PBS洗3次，每次1min。然后滴加羊抗鼠IgG(1∶50)15μL，室温作用30min后，PBS洗3次，每次1min。滴加APAAP复合物15μL，室温作用30min，PBS洗3次，每次1min。滴加碱性磷酸酶底物溶液(含1g/L坚固红)，室温显色5～20min后，用水终止、甲基绿复染、明胶封片。

　　1.2.8重组病毒的富集和滴度测定经APAAP法鉴定能稳定表达人CD19分子的重组痘苗病毒经4次传代后，在含有Xgal的营养琼脂上均为蓝色斑。挑取其中1个蚀斑于1mL维持液中，反复冻融3次后，感染Tk－143细胞(25mL小瓶)。48h后收集，冻融3次，再感染50mL培养瓶中的Tk－143细胞。48h后收集病毒，冻融3次，按1扩4的方式直至感染20个瓶中的细胞。48h后，以12000r/min离心15min，收集细胞，PBS洗两次。最后将沉淀放于5mLPBS中，反复冻融4次后，取上清分装小管，置20℃长期保存。病毒滴度的测定：以10倍稀释法稀释病毒，取0.5mL感染80％成片的TK－143细胞。吸附1.5h后，补加维持液5mL，继续培养48h，弃上清，用10g/L结晶紫室温染色计数空斑。计算公式为：

　　病毒滴度=空斑×2/病毒稀释度(pfu/mL)

　　2　结果

　　2.1人CD19全长基因的扩增根据CD19cDNA基因的序列，利用GOLDKEY软件，我们设计了扩增CD19全长基因的上游(P1)和下游(P2)引物，并将其中大肠杆菌的稀有密码子改为其偏爱密码子。同时，为了克隆表达的方便，我们在上、下游引物中均引入了酶切位点及保护碱基。引物的序列如下：

　　P1：CGCGGATCCAAGCTTTGACCACCATGCCACCTCCTGG　　BamHIHindIII与CD19基因序列9～30bp互补

　　P2：TGCTCTAGAATTGTCCTGGCGACCGGCTGGG　　XbaI与CD19基因序列1420～1442bp互补

　　应用上述引物，以含有人CD19cDNA的质粒为模板，可扩增出1457bp的基因片段。电泳鉴定的结果如图1所示。