PCR-RFLP-SSCP及测序用于霍乱弧菌ctx-AB基因多态性的研究

　　建立PCR-RFLP-SSCP及测序方法，用于分析霍乱弧菌肠毒素AB(ctx-AB)基因多态性。针对ctx-AB基因设计引物，扩增片段为528bp，包括ctx-B编码基因375bp，引物序列为5′-GGT GTA AAA TTC CTT GAC G-3′和5′-GGT TCG ATG ATG AGA AGC-3′。PCR产物经RsaⅠ酶切为317bp和211bp 2个片段。对酶切产物进行单链构象多态性(SSCP)分析，银染色法显示结果。对不同SSCP类型测序，利用PCR方法直接对PCR产物测序。

　　霍乱弧菌O1群古典型(CVC)标准株569B和16017，埃尔托型(EVC)标准株919，O139群标准株MO45，EVC80株(广东省90年代病人分离株)，O139群10株(广东省90年代病人分离株)，由广东省和广州市卫生防疫站提供。PCR扩增ctx-AB基因，上述菌株均产生1条约528bp的片段，扩增产物经RsaⅠ内切酶消化后，在2%琼脂糖凝胶上电泳，均可见1条约317bp的片段和1条约211bp的片段。酶切产物经SSCP分析，分为A和B两个类型，CVC、EVC和O139群标准株均为A型，80株EVC(广东省分离株)中8株为A型，其余为B型；O139群(广东省分离株)均为A型。进一步测序表明两类型基因序列有3个位点不同，以ctx-B基因的起始碱基定位为1，其下游序列为正，上游序列为负，两类型在103、115和203位点碱基不同，A型为A、C和C(相应位点编码的氨基酸为Asp、Tyr和Ile)，B型为G、T和T(相应位点编码的氨基酸为Asn、His和Thr)。与基因库中霍乱弧菌的ctx-AB基因序列比较，B型103位点与国外报道的序列均不同，可能为广东地区菌株特有的突变。PCR-RFLP-SSCP及测序方法快速、简便、准确、经济，适用于对大量标本某重要基因多态性的研究。