天冬氨酸-氨基乙酸共聚材料的合成、表征及降解

　 　　本实验合成了不同摩尔比的天冬氨酸、氨基乙酸共聚材料(PAA)，摩尔比分别为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5。用核磁共振1HNMR、13CNMR、DSC差热分析、特性粘度等方法对材料作了表征，结果表明该共聚材料结构明确并有较好的规律性。用pH7.4的磷酸缓冲溶液、胰蛋白酶缓冲液及P450肝代谢酶等对材料进行了体外降解，实验结果显示，该系列材料在体外有一定的降解性。

　　分类号： 　0657; R318.08

SYNTHESIS, CHARACTERIZATION AND ENZYMATIC

　　DEGRADATION OF THE COFOLYMER OF

　　L-ASPARTIC ACID AND 2-AMINOACETIC ACID

Lou Weijian

　　(Shao Yifu Hospital School of Medical Seience, Zhejiang University, Hangzhou 310006)

　　Tang Guping

　　(School of Pharmaceutical Science, Zhejiang University, The State Key Laboratory of Function Polymer Materials for Adsorption and Separation, NanKai Unversity)

ABSTRACT

　　For the purpose of increasing the hydrophilicity of poly aspartic acid, a series copolymers of L-aspartic acid and 2-aminoacetic acid with different mole ratios were prepared. The structures of copolymers were characterized by 1HNMR、13CNMR、DSC and element analysis. The degsadetion of the copolymers, in vitro at phosphate buffer saline by enzyme solution of trypsin(37℃,pH7.4) and in vivo by hypatic metabolors P450 of Sprase-Dawley nat were carried out. The results indicated that the copolymers could be degraded in some degrees and also showed that 2-aminoacetic acid segments accelerated the degradation of the copolymers.

　　Key words:　L-aspartic acid; 2-Aminoethanoic acid; Copolymer synthesis; Engymatic digsadation

　　聚氨基酸以及它的共聚材料，是广泛应用于临床的生物医用材料，特别是水溶性聚氨基酸材料，是一种典型的生物降解性高聚物，他们在药物控释体系中具有明显的优点。对聚天冬氨酸及其衍生材料的研究已引起国内、外学者的广泛注意［1～5］，G.Giammona［6，7］报道了将天冬氨酸用水合肼作为胶联剂制成水凝胶，以胞嘧啶为目标药物，研究了该凝胶的释药性能；Yasuyosi Miyachi［8，9］则合成了羟烷基-DL-聚谷氨酸，并对其生物降解性作了研究。Toyoji Kakuchi［10，11］在将天冬氨酸与氨基羧酸化合物的共聚方面作了大量的研究,成功地将6-氨基己酸与天冬氨酸共聚，并认为其具有良好的生物相容性。

　　本研究在原有的工作基础上，首次合成了不同摩尔比的天冬氨酸-氨基乙酸共聚物材料，试图通过在聚天冬氨酸的母体材料中嵌入氨基羧酸结构，以改进聚天冬氨酸的性质，使其更具有广泛的应用性。实验用核磁共振、差示热分析、元素分析及特性粘度法对所合成的材料作了表征；用pH=7.4的磷酸缓冲溶液、胰蛋白酶缓冲溶液、P450肝代谢酶等对所合成的材料进行了体外降解实验。结果表明所合成的共聚材料均能降解。

　　1　实验部分

　　1.1　仪器及试剂

　　BRUKER-AM-400核磁共振仪，DSC-7C差示量热仪(美国PE公司)，ELEMENTAR VARIOEEL元素分析仪(意大利)。

　　L-天冬氨酸、氨基乙酸(上海化学试剂总厂)，N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)(临平化工试剂厂)，胰蛋白酶(上海化学试剂公司，进口分装)，其它试剂均为分析纯。

　　1.2　材料的合成

　　将不同摩尔比的L-天冬氨酸和氨基乙酸研细混合，加入5ml 85%的磷酸，2ml蒸馏水混合均匀，在旋转蒸发仪上加热，当温度升至160℃时真空减压到24mmHg，控制温度在160℃左右，反应4h，撤去真空，趁热加入50ml N,N′-二甲基甲酰胺(DMF)，使固体充分的溶解。摩尔比为9∶1、8∶2、7∶3的共聚物在250ml蒸馏水中析出，得白色片状物，过滤，用蒸馏水洗涤至中性，干燥，得白色产物；摩尔比为6∶4、5∶5的共聚物在250ml的无水乙醇中析出的白色絮状物，过滤，用无水乙醇洗涤至中性，干燥，得白色产物。

　　1.3　材料的表征

　　核磁共振1HNMR、13CNMR分析溶剂为CDCl3；差示量热仪温度范围从室温到350℃，升温速率为10℃，气氛为空气。特性粘度采用乌氏粘度计。温度25.0℃，溶剂为DMF。

　　1.4　材料的体外降解

　　1.4.1　材料的体外水解

　　精密称取0.5g材料于三角烧杯中，加入0.02mol/L磷酸缓冲溶液30ml，37.0℃放置三天，经过滤，烘干，称重，计算降解百分率。

　　1.4.2　材料的体外酶解

　　酶溶液配制：称取水解酶胰蛋白酶5g,分别放入50ml的容量瓶中，用0.02M的磷酸缓冲溶液(pH7.40)溶解并定容至刻度。

　　酶活力的测定：样品：吸取酪蛋白溶液2ml于试管中，37℃水预热5min，然后加入预热过的酶液1ml，立即计时，反应10min后，加入3ml 10%的三氯乙酸(TCA)，置37℃水浴10min，过滤，备用。对照品：吸取酶液1ml于试管中，加入10%的 TCA3ml，37℃水浴中放置10min，再加入0.5%酪蛋白溶液2ml，立即计时，37℃水浴中反应10min，过滤，备用。染色：各取滤液1ml，加入5ml 0.55mol/L Na2CO3和1ml福林酚试剂，37℃放置15min，在680nm处测定吸光度值。用酶活力标准曲线求得键合酶的活力。

　　材料的体外酶解：称取一定量的天冬氨酸-氨基乙酸共聚材料各3份，每份约0.5g，置于具塞广口瓶中，分别加入30ml酶缓冲溶液，酶溶液的浓度均为0.001g/ml，三天后，经滤纸过滤，烘干，称重，并求得材料的降解百分率。

　　1.4.3　材料的P450肝代谢酶酶解

　　微粒体的制备：Sprase-Dawley大鼠，雄性体重(180±20g)剖腹后用注射器吸取20ml经过冰浴冷却的生理盐水，经肝门静脉注入肝脏，以灌洗法除去肝中残血。剪下肝脏(以下均在4℃以下操作)，用生理盐水浸洗。滤纸吸干水份后称重，剪碎，按每克肝加4ml 0.25mol/L蔗糖溶液，制成匀浆。9000g离心15min；取上清液，12,500g 15min；取上清液，按10∶1加88mmol/L CaCl2溶液，冰浴5min，摇振，25,000g 15min；取沉淀，用少量溶液(0.25mol/L∶0.1mol/L tris-HCl=95∶5)清洗后按每只大鼠加该溶液8ml稀释并匀浆。微粒体制备物按Lowry法测定蛋白质浓度，分装，置-30℃冷藏备用。蛋白含量为38.89mg/ml。

　　称取一定量的天冬氨酸-氨基乙酸共聚材料(8∶2、7∶3)各3份，每份约0.5g，置于具塞广口瓶中，取微粒体125μl(0.18g)，分别加入30ml酶缓冲溶液，室温保存，三天后，经滤纸过滤，烘干，称重，并求得材料的降解百分率。

　　2　结果和讨论

　　2.1　材料的合成

　　合成反应见图1：

图1　天冬氨酸-氨基乙酸共聚物合成路线

　　图1是天冬氨酸和氨基乙酸共聚物的合成路线，表1 则列出了所合成的共聚材料的有关性质。从合成过程来看，经过研细的原料共混后溶于少量蒸馏水和磷酸中，当温度升高至180℃及达到24mmHg真空后，体系呈无色透明的粘稠物。根据文献报道，聚天冬氨酸可在水中析出，本实验结果表明随着共聚物中氨基乙酸比例的增加(9∶1、8∶2、7∶3)，材料虽仍能够在水中析出，但溶解度略有增加，表现为得率逐渐降低，可能有部分产物溶解于水中。当共聚物中氨基乙酸的比例继续增加(6∶4、5∶5)时，共聚物表现为易溶于水，但能在无水乙醇中析出，得率相对较低。从所得的产物外观来看，天冬氨酸与氨基乙酸的共聚比为10∶0、9∶1、8∶2、7∶3的共聚材料基本为白色粉末，而共聚比为6∶4、5∶5的共聚材料为浅黄色，且随着共聚物中氨基乙酸比例的增加产物颜色逐渐加深。从共聚材料的特性粘度测定情况来看，随着共聚物中氨基乙酸比例的增加其特性粘度逐渐减小，表现为材料的分子量减小。此外，元素分析表明(实验选择了共聚比为8∶2、7∶3的材料进行实验)，8∶2的材料C：49.6%(48.5),N:14.1%(15.7),H:4.4%(3.37),7∶3的材料C:46.9%(48.0),N:14.3%(16.5),H:3.8%(3.53),括号内的为理论值。

表1　材料的性质

编号	天冬氨酸-氨基乙酸 　　共聚比	Tg ℃	T ℃	［η］dl/g	得率(%)
1	10∶1	-	-	1.540	95.2
2	9∶1	89.8	-	0.860	89.2
3	8∶2	78.0	-	0.930	87.5
4	7∶3	73.0	335.0	0.437	86.2
5	6∶4	103.7	345.0	0.269	85.1
6	5∶5	73.8	190.0	0.224	85.3

2.2　材料的表征2.2.1　材料的核磁共振分析

　　图2是聚天冬氨酸和天冬氨酸-氨基乙酸(8∶2)的核磁共振碳谱，由图2(a)可知在δ173.3ppm、172.1ppm是聚天冬氨酸的酰胺环中两个羰基的碳峰，δ47.46ppm是环中次甲基的碳峰，δ32.84ppm是环中亚甲基的碳峰。图2(b)中可知δ173.3ppm、172.1ppm是酰胺环中的

 

图2　天冬氨酸-氨基乙酸共聚材料

　　(8∶2mol/mol)13CNMR图谱(CDC13，25.0℃)

　　2.2.2　材料的差热分析

　　从材料的差热分析图谱来看，它们的玻璃化转化温度(Tg)的变化与材料中氨基乙酸的比例有较大的关系，在天冬氨酸-氨基乙酸的比例为9∶1、8∶2、7∶3时随着共聚材料中氨基乙酸比例的增加，其Tg逐渐下降，分别为89.8、78.0、73.0℃，当共聚材料中氨基乙酸的比例继续增加为6∶4、5∶5时在合成过程中共聚材料易溶于水，需在无水乙醇中析出，其Tg也发生变化，分别为103.7、73.8℃。在熔融温度的测定中9∶1、8∶2的共聚材料未能测出其熔融温度，共聚比为7∶3的材料为Tm为335.0℃，共聚比为6∶4、5∶5的材料其熔融温度Tm分别为345.0℃和190.0℃。

　　2.2.3　材料的降解实验

图3　天冬氨酸-氨基乙酸共聚材料

　　(10∶0、9∶1、8∶2、7∶3)体外降解图

　　◆:天冬氨酸-氨基乙酸共聚材料水解曲线

　　■：天冬氨酸-氨基乙酸共聚材料胰蛋白酶酶解曲线

　　●：天冬氨酸-氨基乙酸共聚材料P450酶酶解曲线

图4　天冬氨酸-氨基乙酸共聚材料

　　(6∶4、5∶5)体外降解图

　　◆:天冬氨酸-氨基乙酸共聚材料水解曲线

　　●：天冬氨酸-氨基乙酸共聚材料胰蛋白酶酶解曲线

　　图3、图4是天冬氨酸-氨基乙酸共聚材料在pH=7.4的磷酸缓冲溶液、胰蛋白酶和P450肝代谢酶中的降解情况。在图3中可知10∶0材料在磷酸缓冲溶液中几乎没有降解，而9∶1、8∶2、7∶3材料则随着共聚材料中氨基乙酸比例的提高，材料降解程度提高，从86.77%到32.96%。在胰蛋白酶中，材料被酶解速率明显快于水解速率，10∶0的材料三天中约降解85.97%，而9∶1、8∶2、7∶3的材料的酶解程度从74.63%降至10.21%。从实验数据来看，可能是水解和酶解的协同过程，但酶解明显快于水解。图4则显示了共聚比为6∶4和5∶5材料的降解情况，由于此两种材料在合成过程中性质略有不同，所以在降解过程所表现的降解程度也有别于其它比例的材料，特别注意的是5∶5材料，由于其溶解性极好，故酶解程度相当高，几乎都已降解。实验还选择了8∶2和7∶3两种材料进行了P450肝代谢酶对其降解，结果表明其降解能力高于胰蛋白酶，三天酶解值分别为39.51%和17.42%，说明肝代谢酶的作用明显。　　图5是共聚比为8∶2的材料在三天中的水解和酶解情况。经非线性回归处理，认为指数方程相关性较好，即符合C=Ke-at方程，故得水解和酶解方程分别为：

C水解=1.046×102×e-0.0092t (n=12 r=0.9917)

　　C酶解=1.002×102×e-0.0102t (n=12 r=0.9954)

　　从方程某一t时刻比较两数值，由于C水解方程中K值比C酶解的大，而a值较小，故有较大的C值，经两两间的方差分析P＜0.01，说明两条曲线有差异。

　　2　结论

　　本实验用不同摩尔投料比合成了天冬氨酸-氨基乙酸共聚物，并用多种方法对共聚材料进行了表征，表明该材料结构明确。用磷酸缓冲溶液、胰蛋白酶缓冲溶液及P450肝代谢酶对共聚材料进行了体外降解，从实验结果来看，该材料有一定的降解，并有一定的规律性。有关材料作为药物载体的工作，正在进行之中。

图5　天冬氨酸-氨基乙酸共聚材料

　　(8∶2)体外降解图和酶解曲线

　　◆:天冬氨酸-氨基乙酸共聚材料体外水解曲线

　　●：天冬氨酸-氨基乙酸共聚材料体外酶解曲线

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