特异性中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂对大鼠移植胰腺再灌注损伤的保护作用

　　【摘要】　目的　研究特异性中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂ONO-5046对移植胰腺再灌注损伤的保护作用。方法　应用同系大鼠异位全胰十二指肠移植模型，ONO-5046治疗组的动物移植术前及术后静脉注射ONO-5046，术后定期分批处死受体，测定大鼠血清中性粒细胞化学趋化性细胞因子(CINC)含量、移植胰腺组织中CINC mRNA的表达及髓过氧化酶(MPO)活性，并进行组织学观察。结果　CINC于再灌注后3小时出现峰值，治疗组为(7.24±1.46)μg/L，对照组为(28.4±1.85)μg/L，差异显著；移植物中CINC mRNA于再灌注后3小时表达最强，治疗组的表达水平明显低于对照组；MPO的活性，治疗组显著低于对照组；治疗组的胰小叶间质水肿及胰小叶间质和胰小叶内的中性粒细胞浸润较轻。结论　ONO-5046能抑制CINC的升高及CINC mRNA的表达，抑制中性粒细胞的浸润，对再灌注损伤具有保护作用。

Protective effects of neutrophil elastase inhibitor(ONO-5046) on the reperfusion injury following pancreaticoduodenal transplantation in rats

WANG Fengshan, LIU Yongfeng, WANG Liming, et al. Department of Surgery, The First University Hospital of China Medical University, Shengyang 110001

　　【Abstract】　Objective　To study the protective effects of a neutrophil elastase inhibitor(ONO-5046) on reperfusion injury following pancreaticoduodenal transplantation in rats.Methods　The homologous male Wistar rat model of heterotopic total pancreaticoduodenal transplantation was used. The ONO-5046-treated animals received the intravenous injection of ONO-5046 5 min before and after operation at a dose of 10 mg/kg, and were killed one by one after operation. Serum concentration of cytokine-induced neutrophil chemoattractant (CINC) determined by enzyme-linked immunosorbant assay, the expression of CINC mRNA detected by Northern blot assay in the pancreatic grafts, and the activity of myeloperoxidase(MPO) were measured. Histological observation was performed.Results　The peak of serum CINC concentrations occurred 3 h after reperfusion with the difference between the groups with and without ONO-5046 being significant. Expression peak of CINC mRNA in the pancreatic graft occurred 3 h after reperfusion with the expression level in the ONO-5046 treated group significantly lower than in the ONO-5046 untreated group. The activity of MPO in the treated group was obviously decreased as compared with in the untreated group.Conclusion　ONO-5046 can inhibit the elevation of CINC, the CINC mRNA expression and early neutrophil accumulation in the pancreas, and have protective effects on the ischemia/reperfusion injury of pancreaticoduodenal transplantation.

　　【Key words】　Blood circulation　　Pancreas/transplantation　　Chemotactic factors　　Protease inhibitors

　　近年研究表明，移植器官缺血再灌注后中性粒细胞向缺血再灌注组织的浸润与器官再灌注损伤有关［1］。中性粒细胞释放的弹性蛋白酶是导致炎症性组织损伤的重要物质，它能使弹性蛋白、纤维蛋白、糖蛋白及胶原等破坏，导致组织损伤［2］。白细胞介素8(IL-8)为中性粒细胞游走因子，能刺激蛋白酶释放，大鼠的中性粒细胞化学趋化性细胞因子(CINC)相当于IL-8［3］。ONO-5046为特异性的中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，它对病理性中性粒细胞弹性蛋白酶增加有抑制作用。笔者应用同系大鼠异位全胰十二指肠移植模型，研究ONO-5046对移植胰腺再灌注损伤的作用。

　　材料与方法

　　一、实验动物和移植手术

　　1. 实验动物：使用雄性Wistar大鼠，体重250～350 g，实验前1周经阴茎背静脉给大鼠注入链脲霉素55 mg/kg，制备非空腹血糖＞19.4 mmol/L的大鼠糖尿病模型。

　　2. 移植手术：依据Lee等［4］的方法进行同系大鼠异位全胰十二指肠移植。

　　二、实验分组

　　1. ONO-5046治疗组：移植术前及移植术后2次经阴茎背静脉按10 mg/kg给受体注射ONO-5046制剂(日本小野药品工业株式会社)。

　　2. 对照组：移植术前及移植术后2次经阴茎背静脉向受体注入与治疗组等量的生理盐水。

　　三、血清淀粉酶、脂肪酶及血清CINC的测定

　　移植术后1、3、6、12、24、72小时分批处死大鼠，每次6只。经腹主动脉采血，测定血清淀粉酶和脂肪酶。应用酶联免疫法测定血清CINC。

　　四、胰腺组织中髓过氧化酶(MPO)活性的测定

　　胰腺移植24小时后，切取移植胰腺，立即置入磷酸盐平衡液中，并将胰腺粉碎，用超声波将细胞破坏，离心后取上清液。将50 μl上清液与200 μl邻二甲氧基苯胺液和200 μl H2O2混合，反应后测定460 nm的吸光度值。MPO活性用吸光度的变化率来表示，为相对值。

　　五、组织学检测

　　胰腺移植术后分期分批处死大鼠，切取移植胰腺，分别进行HE染色和萘酚AS-D氯乙酸脂酶染色(中性粒细胞特异性组织化学染色)，并计算单位面积的中性粒细胞数。

　　六、移植胰腺组织中CINC mRNA表达的测定

　　参照Konishi等［5］的方法测定移植胰腺组织中CINC mRNA的表达。步骤如下：(1)常规提纯总RNA溶液；(2)测定溶液中的RNA浓度；(3)在琼脂糖变性胶上电泳RNA溶液；(4)偏振片摄影确认RNA；(5)于Northern blot转移池中从琼脂糖变性胶上将RNA转移到尼龙膜上；(6)将RNA尼龙膜与同位素标记的cDNA(CINC)探针杂交；(7)放射显影。

　　七、ONO-5046对离体大鼠腹腔巨噬细胞产生CINC的影响

　　1. 于大鼠巨噬细胞悬液中(1×106/ml)加入不同浓度的中性粒细胞弹性蛋白酶(0、0.1、1、5、10 μg/ml)，在5%CO2、37 ℃培养箱中培养6小时，测定上清液中CINC的浓度。

　　2. 向大鼠巨噬细胞悬液中(1×106/ml)加入不同浓度的ONO-5046(0、1、10 μmol/ml)，然后加入等量的中性粒细胞弹性蛋白酶(5 μg/ml)。在5%CO2、37 ℃培养箱中培养6小时，测定上清液中的CINC浓度。

　　八、数据处理

　　所得数值用均值±标准差表示，统计学差异性检验采用t检验。

　　结　　果

　　一、血清淀粉酶、脂肪酶及血清CINC的变化

　　血清淀粉酶与血清脂肪酶均于移植后3～6小时出现峰值，24小时后恢复到术前值。两个组的血清淀粉酶差异不显著，而血清脂肪酶ONO-5046治疗组显著低于对照组。血中CINC于胰腺移植后3小时出现峰值，ONO-5046治疗组为(7.24±1.46)μg/L，对照组为(28.4±1.85)μg/L，两者的差异有显著性，随后逐渐降低，72小时后血中CINC浓度为可测定值以下。

　　二、移植物组织中MPO活性及中性粒细胞数

　　胰腺移植24小时后，ONO-5046治疗组的移植胰腺组织中的中性粒细胞数及MPO活性显著低于对照组。

　　三、移植物组织中CINC mRNA的表达

　　移植胰腺组织中CINC mRNA在胰腺再灌注后3小时表达最强，ONO-5046治疗组移植物中CINC mRNA表达水平明显低于对照组。

　　四、ONO-5046对离体大鼠腹腔巨噬细胞产生CINC的影响

　　体外实验的结果表明，巨噬细胞在中性粒细胞弹性蛋白酶的刺激下，可产生CINC，而ONO-5046可抑制CINC的产生。

　　五、组织学变化

　　胰腺移植术后3、6小时，胰腺组织中未见中性粒细胞浸润，12小时后于血管周围及胰小叶间质内可见少量的中性粒细胞浸润，24小时可见胰小叶间质水肿，胰小叶间质及小叶间的中性粒细胞浸润表现最强。ONO-5046治疗组的胰小叶间质水肿以及胰小叶间质和胰小叶内的中性粒细胞浸润均比较轻。

　　讨　　论

　　缺血再灌注损伤所导致的移植胰胰腺炎，是胰腺移植后的主要并发症之一，中性粒细胞在这个过程中起重要作用。活化的中性粒细胞可产生氧自由基，释放蛋白酶，损伤组织细胞。而中性粒细胞向组织的浸润是在化学趋化物质作用下完成的。本研究结果证明，血中CINC在移植后增高，并有多量中性粒细胞浸润到移植胰腺组织；应用ONO-5046后，血中CINC及中性粒细胞向组织的浸润均显著减少。

　　细胞因子IL-8是在肿瘤坏死因子等的刺激下，由单核细胞及巨噬细胞产生。本实验CINC在胰腺再灌注3小时后呈现峰值，24小时后基本消失，而中性粒细胞于再灌注24小时后在胰腺组织中出现浸润。由此可见，胰腺移植后CINC在中性粒细胞向再灌注组织浸润之前产生，对中性粒细胞起趋化作用。体外实验也证实了中性粒细胞弹性蛋白酶能刺激巨噬细胞产生CINC，ONO-5046抑制了中性粒细胞弹性蛋白酶，从而抑制了CINC的产生。移植胰腺组织中的CINC mRNA表达亦在移植后3小时表达最强，说明血中的CINC由移植胰腺组织产生。

　　MPO存在于多核白细胞内，对中性粒细胞的吞噬等功能有重要作用。组织中的MPO活性的测定，能够反映中性粒细胞的浸润程度。移植胰腺组织中的MPO活性增强，进一步从生物化学角度说明胰腺再灌注后中性粒细胞向胰腺组织内浸润。而且，MPO也可能与再灌注组织内产生的H2O2结合，参与组织再灌注损伤。

　　综上所述，特异性中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂ONO-5046抑制了中性粒细胞弹性蛋白酶，抑制了IL-8的产生，从而抑制了中性粒细胞向再灌注组织的浸润，因此可以减轻移植胰腺的再灌注损伤。

　　参考文献

　　[1]　Jaeschke H, Farhood A, Smith CW. Neutrophils contribute to ischemia/reperfusion injury in rat liver in vivo. Faseb J, 1990, 4:3355-3359.

　　[2]　McGowan SE, Murray JJ. Direct effects of neutrophil oxidants on elastase-induced extracellular matrix proteolysis. Am Rev Respir Dis, 1987, 135:1286-1293.

　　[3]　Watanabe K, Suematsu M, Iida M, et al. Effect of rat CINC/gro, a member of interleukin-8 family, on leukocytes in microcirculation of the rat mesentery. Exp Mol Pathol, 1992, 56:60-69.

　　[4]　Lee S, Tung KSK, Koopmans H, et al. Pancreaticoduodenal transplantation in the rat. Transplantation, 1972, 13:421-425.

　　[5]　Konishi K, Takata Y, Yamamoto M, et al. Structure of the gene coding rat neutrophil chemo-attractant gro. Gene, 1993, 126:285-286.