反义ERK1/2基因治疗对慢性移植物血管病的影响

　　                                        董冲  陈曦林  宫念樵*  郭晖  陈知水叶启发 夏穗生武汉同济医院器官移植外科宫念樵

　　华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究院

　　器官移植教育部/卫生部重点实验室 武汉 430030 

　　【摘要】目的：探讨反义细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase ，ERK）基因治疗对慢性移植物血管病的保护作用及可能的保护机制。方法：建立Brown-Norway至Lewis大鼠腹主动脉移植模型，给予脂质体包装的反义ERK1/2基因转染移植段血管。移植术后60天取移植段主动脉进行组织病理学观察内膜和胶原纤维变化；免疫组化观察移植段血管ERK1/2的表达和CD4＋、CD8＋T淋巴细胞的浸润；ELISA法检测血清中ICAM-1的变化。结果：移植后60天，对照的移植动脉呈慢性移植物血管病表现，血管内膜显著增厚，移植血管中ERK1/2高表达，CD4＋、CD8＋ T淋巴细胞大量浸润；反义基因处理后移植动脉呈血管内膜炎改变，ERK1/2表达不明显，内膜有少量CD4＋、CD8＋T淋巴细胞；对照组ICAM-1表达显著高于反义基因治疗组(p<0.05)。结论：反义ERK1/2基因治疗对移植物血管具有保护作用，可以减缓慢性移植物血管病的发生，这种保护机制可能和减少ICAM-1的表达、减少移植血管T淋巴细胞的浸润有关。

　　【关键词】  血管移植；慢性移植物血管病；丝裂素活化蛋白激酶；细胞外信号调节激酶；ICAM-1

　　The impact of anti-sense ERK1/2 gene therapy upon chronic graft arteriosclerosis in rat aortic transplants. Dong Chong, Chen Xilin, Gong Nianqiao, Guo Hui，Chen Zhishui. Institute of organ transplantation, Tongji Hospital, Tongji medical college, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, 430030

　　【Abstract】Objective: To investigate the protection and possible mechanisms of anti-sense ERK1/2 gene therapy upon chronic graft arteriosclerosis in rat aortic transplants. Methods: Male Lewis (LEW, RT1l) rats received male Brown Norway (BN; RT1.An) aorta allografts. The group of anti-ERK1/2 gene therapy was transfered anti-ERK1/2 gene. The rats were sacrificed 60 days after the operation and the grafted aortas were evaluated histologically and immunohistochemically. And used ELISA to detect the change of ICAM-1 in different groups. Results: Control groups were presented chronic graft arteriosclerosis,marked neointima formation was observed, with distinct expression of ERK1/2 and T lymphocyte infiltration in neointima, media, and adventitia, marked expression of ICAM-1 in serums; In anti-ERK1/2 therapy group, neointima formation was halted,just few ERK1/2 expression and T lymphocyte were infiltrated in the neointima,and express of ICAM-1 was inhibited. Conclusion: Anti-sense ERK1/2 gene therapy can prevented the development of graft arteriosclerosis in the rat aortic transplant model and the protective role may correlate with decreased expression of ICAM-1,and inhibition of the infiltration of CD4＋ and CD8＋T lymphocyte.

　　Key words  aorta transplantation; chronic transplant arteriosclerosis; mitogen activated protein kinase（MAPK）; extracellular signal-regulated kinase(ERK); ICAM-1

　　随着新型免疫抑制剂在器官移植中的运用,移植后急性排斥反应发生率显著降低，同时慢性排斥反应上升为导致移植物失功的重要因素。如何控制慢性排斥反应成为目前器官移植领域亟待解决的问题。细胞外信号调节激酶 (extracellular signal regulated kinase,ERK1/2)是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族的主要成员之一,当其特异的苏氨酸/酪氨酸双位点磷酸化时被活化[1]，可将信号传导给细胞核，从而调节细胞增殖、分化和有丝分裂。本研究采用针对ERK1/2的mRNA的反义基因治疗，研究其对慢性移植物血管病的影响。

　　材料和方法

　　一. 实验材料

　　１.实验动物：供体为近交系雄性Brown-Norway鼠，受体为近交系雄性Lewis鼠，体重200-300g，购自北京维通利华生物公司。

　　2.试剂：全硫代修饰的寡核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)由上海生工公司合成,序列参照文献[2], ERK1/2反义寡核苷酸(anti-sense ODN,ASO)序列为: 5′GCCGCCGCCGCCGCCAT 3′,与ERK1/2mRNA翻译起始部位的17个碱基的序列互补；随机ODN(random ODN):5′CGCGCGCTCGCGCACCC 3′,所含碱基的种类和数量与反义ODN相同,但顺序随机排列;脂质体Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司；ERK1/2单克隆抗体购自Cell Signaling公司；小鼠抗大鼠CD4＋ 和 CD8＋单克隆抗体购自SantCruz公司；SP试剂盒购自北京中山生物技术有限公司；大鼠ICAM-1 ELISA试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。

　　二.实验方法

　　1. ERK1/2基因包装：

　　反义ERK1/2和随机ERK1/2与脂质体均按1:2（体积）比例混合，基因浓度为１μg/μl,振荡混匀30分钟后灌注移植动脉。

　　2. 实验分组：

　　实验共分三组，每组6只大鼠接受血管移植。对照组无特殊处理；随机序列对照组转染脂质体包装的随机ERK1/2寡核苷酸100μl；反义基因治疗组转染脂质体包装的反义ERK1/2寡核苷酸100μl．

　　3. 动物模型与基因转染:

　　BN鼠对Lewis鼠腹主动脉移植模型参照Shimizu H方法进行[5]。取供者血管，肝素冲洗管腔，随机序列对照组、反义基因治疗组移植血管灌注脂质体包装的随机、反义ERK1/2寡核苷酸，置于4℃保存，1小时后移植。术后一月内随机序列对照组、反义基因治疗组间日注射脂质体包装的随机、反义ERK1/2寡核苷酸100μl，用1ml生理盐水稀释,从尾静脉/阴茎背静脉注入。

　　4. 组织形态学检测：

　　血管移植物于术后60天取出。标本4% PFA固定、包埋，切片行HE染色观察移植物病理表现；应用计算机图象分析系统采集图像，每个标本高倍视野下随机取5处，测量增生内膜厚度，取平均值；Masson三色染色观察胶原纤维分布。

　　5．免疫组织化学法检测移植动脉ERK1/2表达和CD4＋、CD8＋T淋巴细胞的浸润

　　按照SP免疫组化试剂盒说明书操作。阳性判断：MAPK阳性为胞浆呈棕黄色颗粒状；CD4＋ 、CD8＋T淋巴细胞细胞膜呈棕黄色颗粒状。计算每400x视野阳性细胞数。

　　6. ELISA法检测血清中ICAM-1的变化

　　术后60天取受者静脉血分离血清，测血清中ICAM-1的浓度。

　　三．统计学处理

　　实验数据采用SPSS11.5统计软件包进行分析，所有结果用均数±标准差表示。组间比较采用t检验，p<0.05差异有显著性。

　　                          结     果

　　1. HE染色及Masson 三色染色

　　对照组、随机序列对照组病理为典型的移植物血管病的表现：内膜显著增厚，大量成纤维细胞增生，中膜含4-6层弹力纤维和平滑肌构成，内弹力纤维有断裂（图1A、B）；Masson染色显示增生的血管内膜由大量的绿色胶原构成（图1D、F）。反义基因治疗组病理呈移植动脉内膜炎表现：内膜增生不明显，细胞有水肿，内膜有少量淋巴细胞浸润（图1C）；Masson染色内膜胶原纤维增生不明显（图1F）。

　　图1A、B、C分别为对照组、随机序列对照组、反义基因治疗组200倍HE染色病理图片；

　　D、E、F分别为对照组、随机序列对照组、反义基因治疗组200倍 Masson染色图片。

　　2.移植动脉ERK1/2蛋白表达和CD4、CD8＋T淋巴细胞浸润

　　对照组、随机序列对照组移植动脉大量的CD4＋/CD8＋T淋巴细胞浸润（图2A、B），ERK1/2蛋白明显表达在内膜增生的成纤维细胞和浸润的淋巴细胞中（图2D、E）；反义基因治疗组移植动脉内膜下有少量CD4＋/ CD8＋T淋巴细胞浸润（图2C），仅见少量表达ERK1/2蛋白的淋巴细胞、成纤维细胞（图2F）。

　　表1 移植动脉血管内膜厚度、CD4＋/CD8＋细胞浸润、ERK1/2阳性细胞数比较

　　组 别

　　例数

　　内膜厚度（µm）

　　CD4＋

　　CD8＋

　　ERK1/2＋

　　对照组

　　随机序列对照组

　　反义基因治疗组

　　6

　　6

　　6

　　90.87±15.06

　　88.34±13.50

　　19.37±6.34＊

　　88.40±17.23

　　89.00±16.17

　　49.20±21.16＊

　　45.20±10.18

　　46.20±9.96

　　26.30±5.58▲

　　36.40±4.22

　　35.60±8.29

　　8.40±2.07＊

　　▲      表示与对照组相比p<0.05 ＊表示与对照组相比p<0.01 

　　         图2A、B、C分别为对照组、随机序列对照组、反义基因治疗组400倍CD4＋免疫组化图片；

　　D、E、F分别为对照组、随机序列对照组、反义基因治疗组400倍ERK1/2蛋白表达的免疫组化图片。  

　　3.血清ICAM-1浓度

　　对照组和随机组血清ICAM-1的值显著高于实验组，其差异有统计学意义。

　　表2 各实验组血清中ICAM-1的值比较

　　组 别

　　例数

　　取血时间（天）

　　sICAM-1值(ng/ml)

　　对　照　组

　　随机序列对照组

　　反义基因治疗组

　　6

　　6

　　6

　　60

　　60

　　60

　　        61.510 ± 15.299

　　        64.088 ±13.674

　　38.682 ± 14.429▲

　　▲      表示与对照组相比p<0.05

　　讨　　论

　　慢性排斥反应的主要表现是移植物血管病，其特征是新生内膜的形成和血管闭塞、血管周围炎性细胞浸润、间质纤维化［3,4］。临床研究表明移植物血管病术后三年发生率大约40%，五年发生率增加到50%[5] 。移植物血管病的发生机制包括免疫及非免疫因素,其中免疫反应是引起移植物血管病的核心因素，非免疫因素在免疫因素的基础上发挥作用。CD4＋和CD8＋T淋巴细胞在移植的急、慢性排斥反应中均起到关键作用。缺乏功能性T淋巴细胞的裸鼠接受主要组织相容性抗原不同的血管移植后，不出现慢性移植物血管病，但当接受CD4＋T淋巴细胞输入后病理表现出慢性移植物血管病[6]；小鼠心脏移植模型也证明CD8＋T淋巴细胞的浸润是导致慢性排斥发生的重要因素[7]。通过转基因的方法将调节基因导入体内或移植物内，可以有效地通过改变细胞因子的表达和减少淋巴细胞的浸润，从而减缓排斥反应的发生和增强移植物的自我保护功能。

　　MAPK家族在细胞的增殖、分化、转化、凋亡等方面起着重要作用，主要包括p38MAPK、JNK/SAPK和ERK1/2三个亚族,由一组级联活化的丝/苏氨酸白激酶组成。该家族广泛存在于各种细胞中，对细胞周期运行和基因表达具有重要调控作用，是细胞为维持自身正常机能的保护性反应。p38MAPK和JNK/SAPK家族参与炎症反应调控以及T细胞分化和凋亡的调控;ERK1/2调节T淋巴细胞的活化、增殖和ICAM-1等细胞因子的表达。阻断MAPK通路可以减缓排斥反应的发生[8，9,10]。

　　体外实验发现ERK1/2的活化与ICAM-1的产生密切相关：ERK1/2活化可以增加ICAM－1的水平，而当ERK1/2通路被阻断时ICAM-1的水平降低[11,12]。本实验检测血清中ICAM-1水平发现反义ERK1/2基因治疗组低于对照组和随机组（p<0.05），可能是通过阻断ERK1/2通路阻断了ICAM-1的mRNA的合成，降低ICAM-1的表达，进而下调受鼠体内sICAM-1的水平。该结果进一步在体内实验中证实了ERK1/2通路与ICAM-1表达的关系。ICAM-1在器官移植排斥反应中的作用表现在以下方面：（1）免疫识别阶段，在抗原呈递细胞和T淋巴细胞之间介导细胞－细胞的黏附，并作为复合刺激信号；（2）免疫效应阶段,参与T淋巴细胞和靶细胞之间的粘附及相互作用,导致各种细胞因子上调。ICAM-1的下调能够抑制炎症反应中淋巴细胞的趋化和减弱T淋巴细胞对抗原呈递细胞的识别［13］。特别是有实验表明使用ICAM-1单抗治疗中能够延长移植物存活，并可明显改善慢性排斥的病理表现[14]。这说明ICAM-1的下调能够减少CD4＋和CD8＋T淋巴细胞在移植物中的浸润。提示反义ERK1/2基因治疗对移植物血管的保护作用可能是通过降低受体鼠内ICAM-1的表达，从而减少CD4＋和CD8＋T淋巴细胞的浸润。

　　BN-Lewis鼠的原位腹主动脉移植是一种简化的慢性移植物血管病模型，病变在移植后60天表现即很典型。实验结果显示反义ERK1/2基因治疗后移植物中ERK1/2表达低于对照组和随机序列对照组，反义ERK1/2基因治疗组CD4＋和CD8＋T淋巴细胞的浸润明显低于对照组和随机序列对照组，并且减缓了慢性移植物血管病的发生，表明CD4＋ 和CD8＋T淋巴细胞的浸润与慢性排斥的发生有着密切的关系。

　　使用反义ERK1/2寡脱氧核苷酸基因治疗可以减缓慢性移植物血管病。MAPK信号传导通路在慢性排斥中的作用将越来越为人们所认知，采取各种手段干预该通路从而延缓慢性移植物血管病的发生是一项有前途的研究。

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　　基金项目：国家自然科学基金资助项目（30300324）

　　作者地址：武汉华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究院   邮编：430030

　　通讯作者：宫念樵 Email：nqgong@tjh.tjmu.edu.cn