精索静脉曲张(varicocele,VC)是指由于静脉回流受阻或瓣膜失效血液返流等因素导致精索静脉的伸长、扩张及迂曲,是导致男性不育的外科疾病中最常见的一种。VC在男性人群中的发病率为15% ~20%,在不育男性中发病率为25% ~40%[1]。目前,关于VC导致不育的分子病理机制取得了很大进展,同时,对VC的手术指征和术式的选择也渐趋统一。本文介绍VC导致不育的细胞分子机制及临床决策的进展。四川省医学科学院・四川省人民医院男科涂肇中

1　VC导致不育的细胞分子机制

VC对男性生殖的影响存在很大个体差异,从生育力正常到严重的少弱畸精子症甚至无精子症,这使得VC与男性不育的关系变得扑朔迷离。近年,随着基础研究的不断深入,尤其是分子遗传学方面的进展,使人们逐渐认识到基因多态性及基因突变可能是VC对生殖表型的影响存在异质性的原因。尽管VC导致男性不育的机制尚未完全阐明,但目前有关VC导致不育的细胞分子机制取得了两方面的重要进展:生精细胞凋亡异常和氧化应激(OS)。生精细胞凋亡增多可以导致少精子症甚至无精子症,氧化应激可以导致精子活力减弱、顶体反应受损、精子DNA损伤等,其中,相关基因的多态性和基因突变与生精细胞凋亡异常和氧化应激病理损害的结果有关。

1.1　生精细胞凋亡异常

1.1.1　VC导致睾丸内生精细胞凋亡增加　生精细胞凋亡异常是VC导致不育的重要细胞分子机制,这是近年VC导致不育病理机制研究上取得的进展之一。正常的生精过程存在生精细胞凋亡,以维持生精细胞与支持细胞的适当比例、清除过多或DNA损伤严重的生精细胞。睾丸生殖细胞的凋亡在精子发生过程中起重要的调控作用,凋亡异常与生精功能障碍密切相关。近年来,动物试验和临床研究均支持VC导致生精细胞凋亡增多的结论。Has-san等通过对46例VC不育、18例VC生育患者和8例生精功能正常的梗阻性无精子症患者的睾丸活检结果进行对比研究,发现两组VC患者的睾丸生精细胞、间质细胞凋亡指数较梗阻性无精子症患者均明显升高,且在VC合并不育组中,生精低下、严重生精低下及生精阻滞的患者,其凋亡指数依次增加,提示生精细胞凋亡不仅是VC所致的生精损害的病理机制,而且与生精损害程度有关。

1.1.2　VC导致精液中精子凋亡相关表型增加　除了导致睾丸内生精细胞及间质细胞凋亡增加外,最近研究发现,VC还可导致精液中精子凋亡相关表型增加,包括精子质膜磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl-serine,PS)外翻、线粒体功能障碍及精子核DNA损伤。精子质膜的完整性是精子具备正常受精能力的重要因素,质膜功能损害主要始于PS外翻, PS外翻后可被吞噬细胞识别,是细胞凋亡早期特征之一。如果在精液分析中发现精子质膜PS外翻,提示凋亡的精子逃逸了吞噬作用。线粒体跨膜电位下降也是凋亡的早期特征。精子DNA的完整性对生物遗传非常重要,是保证胚胎、胎盘正常发育、避免缺陷胚胎及遗传缺陷的重要前提。Wu等研究表明,与正常对照组比较,VC患者精液中精子PS外翻、线粒体功能障碍及精子DNA损伤增加,而精子密度及活力与正常对照组却无显著差异。这表明精液常规分析参数正常的VC患者存在精子的凋亡损伤。质膜损伤的精子精卵结合可发生障碍,而精子核DNA损伤时,虽然精子活力可不受影响,可具有受孕能力,但研究发现,精子核DNA损伤与反复自然流产、着床、胎盘异常及子代疾病如儿童期肿瘤、先天性软骨发育不全有关。

1.1.3　VC导致生殖细胞凋亡增加的机制　VC导

致生殖细胞凋亡增加可能与以下因素有关:①DNA合成功能减退、代谢酶的缺乏、细胞核的不稳定性增加;②睾丸/阴囊内高温,研究得出其与生精细胞凋亡明显相关,可能与冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNAbinding protein, Cirp)和热休克蛋白A2(Heat shock proteinsA2, HSPA2)的表达下调有关;③FSH和睾酮水平紊乱,导致凋亡调控机制失调,睾酮水平降低,雌激素和游离性激素结合球蛋白增加,能造成生精阻滞。FSH水平的升高,还可导致抗氧化作用的有效性降低;④血睾屏障的破坏,导致细胞因子生成增多,促进凋亡;⑤附睾上皮的凋亡增加影响附睾分泌功能[10];⑥VC患者生精细胞caspase-3蛋白表达增加、细胞核水平Bcl-2过度表达等导致凋亡增多[11];⑦VC患者间质细胞的血红素氧合酶同工酶-1(HO-1)表达增加,导致CO生成增多,同时促进Leydig细胞凋亡(细胞数量减少,残留细胞的体积增大、核形态改变增加);⑧精浆中具有对抗凋亡的可溶性Fas (sFas)减少而具有促凋亡作用的FasL增加[13],但术后sFas水平增加。⑨镉的毒性作用:VC时,静脉同流阻力增大,睾丸内静脉压力增高,血浆与睾九间质组织液交换增加,血中的镉随之进入睾丸间质,并通过睾丸特异性的电压依赖性钙通道(L-VDCC)进人生精细胞。该通道是Ca2+的特异性通道,正常情况下只允许Ca2+通过。VC患者睾丸L-VDCCα1c亚单位的基因存在多态性,部分患者由于该基因外显子7和/或8缺失,而使位于生精细胞膜的该通道蛋白对Ca2+选择性降低,允许Cd2+通过,镉进入生精细胞。镉通过抑制抗氧化酶的活性而使ROS生成增加及破坏细胞肌动蛋白损伤细胞骨架诱发凋亡。L-VDCCα1c基因有缺失的VC患者睾丸镉含量高,生精细胞凋亡增加,而L-VDCCα1c基因正常的VC患者睾丸镉含量则无明显变化。

1.2       氧化应激　近年研究发现氧化应激是VC导致不育的重要分子机制。活性氧(ROS)过

生成和抗氧化机制缺陷可导致氧化应激。ROS包括H2O2及外周轨道上含有未配对电子的不稳定自由基如羟自由基、超氧阴离子、氮自由基等。精浆中的ROS主要来源于胞质残留的畸形精子和白细胞,正常水平的ROS在精子获能和顶体反应中发挥着重要的作用。过量的ROS可通过直接氧化损伤精子质膜、导致生精细胞或精子DNA单链和双链断裂、破坏DNA完整性,导致生精细胞损伤,引起不育或发生胚胎缺陷。VC导致的氧化应激可发生在睾丸、精浆、附睾及血浆等部位。

1.2.1          VC导致的睾丸内氧化应激　VC患者的睾丸组织中氧化应激明显增加,睾丸内氧化

应激可造成生殖细胞氧化损伤或凋亡等。Koksal等通过睾丸活检研究发现,VC不育患者睾丸组织中脂质过氧化反应增加,且与VC程度有关,亚临床型VC患者轻,而Ⅲ度VC患者最重。Shiraishi等研究表明,VC患者睾丸组织中脂质过氧化的主要代谢产物4-羟烯酸(4-HNE)修饰的蛋白及4-HNE修饰的P53蛋白表达显著增加,表明睾丸内存在氧化应激。

1.2.2　VC导致的精浆氧化应激　VC患者精浆中MDA和NO水平明显增加,提示氧化应激水平升高。精浆氧化应激的水平与VC程度存在明显正相关,如VC合并生殖道感染,则更重。ROS与抗氧化能力(total antioxidant capacity, TAC)的平衡性在氧化应激的发生过程中非常重要,而VC正是打破了这种平衡。Sharma等[20]曾将ROS-TAC评分用于评估血浆氧化应激水平,并得出评分小于30则提示氧化应激水平升高。研究发现VC患者精浆中ROS-TAC评分明显低于正常男性[21]。研究还发现VC患者精浆中辅酶Q10的含量明显增加,提示精子细

胞内抗氧化能力降低,手术治疗VC后,则精浆辅酶Q10明显减少,同时抗氧化物质(如SOD、过氧化氢酶等)明显增加。

1.2.2          VC导致的附睾氧化应激　附睾中产生的自由基如未及时清除,也会产生氧化应激,进

而损伤附睾分泌的蛋白质、破坏精子质膜流动性、影响精子DNA完整性。附睾中的自由基主要来源于附睾组织、精子细胞和管腔中的白细胞。Wang等[23]近来研究得出VC大鼠附睾中低氧诱导因子1α明显高于正常大鼠,而唾液酸和肉碱含量明显减低,同时唾液酸和肉碱含量与低氧诱导因子1α呈负相关性,提示VC可以导致附睾抗氧化机制异常,这与附睾功能损害密切相关。

1.2.3          VC导致的血浆内氧化应激　VC患者血浆内氧化应激的增多是VC导致DNA损伤

和凋亡紊乱的原因之一,其中DNA损伤最重要的产物之一是8-羟基脱氧鸟苷( 8-hydroxydeoxyguanosine, 8-OHdG),研究发现VC患者精索静脉内8-OHdG较外周静脉明显增加,且与线粒体DNA损伤明显相关。研究还发现VC患者精索静脉内含羧基的蛋白质较外周静脉明显增多,这与精浆抗氧化能力呈明显的负相关性[8]。VC患者的精索静脉内具有过量的黄嘌呤氧化酶和NO,一些未成年患者的丙二醛水平亦有升高[25],这些均可导致氧化应激。有研究表明未成年患者精索静脉内OS水平升高有限,而成年后则可能发生全身性的OS,这也证明了VC的病程是进展性的,需及时治疗。

VC导致氧化应激产生的机制与多种因素有关,正常水平的白介素可以调节Sertoli和Leydig细胞的功能[8], IL-1、IL-6是一种前炎症因子,研究发现VC患者IL-1、IL-6表达增加,导致ROS生成增多,进而通过炎性反应损害睾丸组织[27]。VC患者精索静脉内NO水平明显升高[28],过多的NO与超氧阴离子反应会生成氧化亚硝酸盐和氧化亚硝酸,均为强氧化剂;NO可造成丙二醛的增加,进而导致过多的脂质过氧化反应;NO能抑制NADPH脱氢酶和Leydig细胞内细胞色素氧化酶P450的活性,进而降低精子活力、影响睾酮合成;NO还可导致iNOS的过度表达,进而抑制DNA合成和线粒体呼吸链中的酶对正常细胞产生毒性,抑制精子运动能力及降低顶体反应率。正常睾丸组织Leydig细胞有大量的TGF-β-1因子及其受体存在,该受体在长形精子细胞中也有表达,在其他细胞则无表达。然而,在VC患者的Sertoli和生殖细胞中TGF-β-1表达明显增高,造成生精功能紊乱,可能是由于NO增加了TGF-β-1的表达。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic fac-tor, GDNF)是大脑内重要的生长因子,同时在精子发生和DNA合成方面发挥重要作用,研究发现VC患者生殖细胞中GNDF受体α1明显减少,该受体可以保护神经细胞,对抗氧化应激,其含量减少则可能造成氧化应激水平增加。瘦素(Leptin)和其受体主要在精母细胞和间质细胞中表达,调控生殖细

胞的增殖和分化[34]。研究得出Leptin具有抗氧化能力,而过多的Leptin会导致线粒体产生过氧化物、脂质过氧化等。在VC合并少精子症患者中发现,Leptin表达明显高于生育力正常者,可能是代偿机制或受体上调的表现,尽管目前尚无VC患者中Leptin导致OS的直接证据,但可能是机制之一。吸烟、前列腺炎等与精液白细胞升高相关,VC患者如合并这些因素存在,则更易造成ROS生成增多及氧化损伤。

Wu等[36]通过中国地区的63例VC合并不育患者研究得出,谷胱甘肽S-转移酶的变异可能是导致VC患者氧化损伤的重要因素。研究发现同型谷胱甘肽S转移酶M1基因型阴性的患者,精子DNA中8-羟基-2 '-脱氧鸟苷水平明显增加,这样的患者存在大量的线粒体DNA损伤,从而造成精子活力低下,因而线粒体DNA损伤,如4 977碱基缺失可做为OS的分子标志之一进行运用。这些研究也说明了谷胱甘肽S-转移酶基因型阴性的VC患者易出现氧化损伤进而不育,而该酶基因型正常的患者可能表现为生育力正常。

2　VC治疗的临床决策

VC伴精液质量下降的患者,可首先保守治疗,包括改善生活方式、口服改善精子质量的药物等。如果保守治疗效果不明显,可考虑手术治疗。手术治疗后是否能够改善生育力,过去一直存在争议,近来这种争议已经渐趋统一,尤其是随着显微外科手术治疗VC临床资料的报道。来自WHO的结论指出VC与睾丸间质细胞功能损害和精子质量下降明确相关。尽管随机对照试验(RCT)是临床I期研究的金标准,但既往关于VC手术前后生育力改善情况的RCT研究仍然存在许多问题,包括病例选取中含有亚临床的VC、VC合并正常精液参数、样本脱落数较大等。近来Marmar等[37]进行了一项设计科学的Meta分析研究,文章纳入标准包括:①仅包括临床型VC并不育患者,伴随精液参数的一项或多项异常;②治疗方法只限于外科手术;③术后生育力改善的观察指标为自然怀孕率。同时为了减少偏倚,观察者对所有文章、数据均全盲判定。结果从1985年至2007年,共纳入文献5篇。VC手术后自然怀孕率,相比未治疗或药物治疗,其OR值为2. 87(95% CI: 1. 33~6. 20),手术后自然怀孕率较未治疗或药物治疗组高2. 87倍。对于不育夫妇,女方生育力正常或可通过治疗达到正常,男方存在临床型VC,同时精液分析存在异常,应当行手术治疗,对于精液分析暂时正常,但以后可能异常的患者,亦应手术治疗。

研究发现青少年期OS在精索静脉内的作用会有所限制,但成年后却会出现明显的系统性的氧化应激影响,这也证明了VC是一种进展性的疾病,应当早期诊疗。许多导致氧化应激的因素可以通过VC的手术治疗改善,如减少4 977碱基线粒体含量、DNA氧化损伤、硝酸盐及亚硝酸盐含量等。同时,许多抗氧化物质也明显增加,如锌、硒、维生素E等。VC手术治疗不仅对精液质量有益,其还可以改善睾丸间质细胞功能,增加睾酮水平,间接提高生精功能。自然怀孕率是目前研究VC手术后改善生育力的最佳指标,但在既往研究中,术后治疗方法的差异、女方因素等亦可能造成结果的误差。因而将来关于VC治疗方法的比较,仍需要进行大样本的前瞻性随机对照研究。

VC的外科治疗方法包括开放手术、腹腔镜手术、栓塞及硬化剂治疗。其中栓塞或硬化剂治疗,鉴于其手术失败率较高和复杂的并发症可能,较少运用于临床,过去曾认为其可用于术后复发VC的治疗,但近来发现显微外科手术在复发VC中运用可以获得更满意的效果。

迄今为止,对于VC的最佳术式,仍然没有一个前瞻性临床随机对照试验研究。选择最佳术式所考虑的方面,应当包括术后精液质量的改善、自然怀孕率的提高、并发症的减少,如复发率、鞘膜积液、睾丸萎缩等,这要求完全结扎精索内外静脉的同时,保护好动脉和淋巴管。近来Cayan等对1980年至2008年符合纳入标准的36篇文章进行了Meta分析研究,他们得出自然怀孕率在不同术式中存在明显差异,显微外科组最高(41. 97% ), Palomo术式组、Ivanissevich术式组、腹腔镜组分别为37. 69%、36. 00%和30. 07%。总体复发率在Palomo术式组中最高(14. 97% ), Ivanissevich术式组、腹腔镜组分别为2. 63%和4. 30%,显微外科组最低(1. 05% )。术后鞘膜积液发生率在Palomo术式组中最高(8. 24% ),显微外科组最低(0. 44% ),腹腔镜组、Ivanissevich术式或外环下术式组分别为2. 84%和7. 30%。

腹腔镜手术后鞘膜积液发生率较低,但该术式对精索外静脉的漏扎,明显增加了复发率。同时腹腔镜手术可能造成肠管、血管损伤,对手术技巧、麻醉、费用等要求均较高,不应作为VC手术治疗的首选。Palomo术式在腹膜后结扎精索静脉,此处静脉分支较少,不易漏扎,但同样无法处理精索外静脉,增加了复发率。Ivanissevich或外环下术式可以同时结扎精索外静脉,降低了复发率,但同时增加了动脉和淋巴管损伤的几率[41-42]。显微外科方法是经过腹股沟或外环下入路进行操作,是Ivanissevich或外环下术式的改进。其中外环下入路时,精索内静脉分支较多,微小的睾丸动脉容易损伤,需要更多的手术技巧[41],因而,显微外科手术选择经腹股沟入路较有优势。

显微外科手术降低了漏扎静脉、损伤动脉及淋巴管、鞘膜积液等各种并发症的发生率。曾有许多报道认为VC手术中误扎睾丸动脉不会造成睾丸萎缩,但近来研究认为保留睾丸动脉,才能保证最佳的睾丸血供。因此,在各种术式中,显微外科手术以其创伤小、并发症少、经济负担轻、术后复发率低、可明显改善精液质量和自然妊娠率等优势,可被认为是治疗VC的最佳选择。

近来,随着VC伴不育分子机制的研究深入,许多基因突变的检测有望作为VC的细胞分子手术指征而运用于临床。精子细胞膜PS外翻、线粒体跨膜电位降低、精子DNA断裂、L型电压依赖钙离子通道α1c基因微缺失、同型谷胱甘肽S转移酶M1基因型阴性、线粒体DNA 4 977碱基缺失等的检测,可以提示睾丸内生殖细胞凋亡和氧化应激情况,存在这些基因突变的精液在常规分析中可能是正常的,但可导致精卵结合、胚胎发育、遗传缺陷等一系列后果,因而是存在手术指征的。这些检测对于VC合并不育,但精液常规分析正常,欲行ICSI的患者显得更加重要。