全世界有1.7亿人感染慢性丙型肝炎病毒（Hepatits C virus, HCV），其中在亚洲和非洲人中感染为著。自从上世纪90年代以来对献血员进行丙型肝炎病毒筛查以来，慢性丙型肝炎的感染率明显下降。然而，某些人群对丙型肝炎病毒具有明显的易感性，这些人群包括共用针具的静脉药瘾者、接受不安全的输血治疗者等。在所有的HCV感染的个体中，80%的感染者发展慢性HCV感染[1]，10-20%发展成为肝硬化[2]，1-5%的慢性感染者发展成为原发性肝癌[2]。因此，慢性HCV感染的流行成为世界各国一项重要的社会经济负担。在发达国家，慢性HCV感染是肝移植失败的主要原因。迄今为止，尚未发现行之有效的HCV疫苗用于预防HCV感染。慢性丙型肝炎患者通常使用干扰素和利巴韦林联用进行抗病毒治疗，但这种治疗疗程长、价格昂贵、副作用多，且有效率仅只有50%。干扰素治疗的副作用包括：中性粒细胞减少或缺乏、流感样症状、神经精神症状如抑郁、自身免疫性综合征如自身免疫性甲状腺炎。在HCV病毒基因型2型或3型患者中，血清持续病毒免疫应答率可达80-90%，但在基因1型患者中应答率只有50%[3]。因此，发展有效的HCV预防性和治疗性疫苗对控制慢性HCV感染具有重要意义。北京地坛医院感染性疾病诊疗中心肖江

　　1. HCV病毒遗传多样性

　　HCV为单股正链RNA病毒，属于黄病毒属，HCV基因组全长约9.6 kb。含有下列基因结构：(1)一个大的开放阅读框(ORF)，编码约3 010氨基酸长的多聚蛋白前体，这个蛋白前体通过宿主和病毒蛋白酶的裂解作用产生至少10个蛋白，排列如下: 氨基端(NH2)-核心蛋白(core)-包膜蛋白1(envelope，E1)-E2-p7-非结构蛋白2(Nonstructural protein 2，NS2)-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-羧基端(COOH)，这些病毒蛋白并不仅在病毒复制中起作用，也影响宿主细胞内多种功能。(2)基因组5’端为5’非翻译区(NTR)，全长341个核苷酸(nt)，位于ORF的上游，在5’-NTR中存在一个内部核糖体进入位点(IRES)，它是一种最复杂的顺式激活元件，指导核糖体40S亚基与ORF的起始密码子AUG相结合，从而指导ORF的翻译，最近一些研究表明其还具有调节HCV RNA复制的作用[4]。 (3)ORF下游是3’-NTR: 其长度是可变的，包括三个结构: 一个短的约40个nt的可变序列，其后有终止密码子，他对于HCV基因组的复制并不是必需的[5] ；大约30-150 nt的多聚poly(U/UC)序列；大约98 nt的高度保守的“X尾”异源多聚序列，其3’-末端有一个46 nt的序列可形成稳定的茎-环(stem-loop) 结构，他对于体内及细胞培养系统的RNA复制来说是必需的。NS5B蛋白为RNA依赖的RNA多聚酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，由于其缺少校读功能，使得HCV RNA复制过程中错误的核苷酸随机进入病毒基因组，有些核苷酸错误对病毒是致命性的；有些则是“非致命性的”。病毒虽出现核苷酸变异，但病毒蛋白的氨基酸不发生变异，即无义突变；第三类即发生正义突变，导致氨基酸变异，使得病毒蛋白的功能改变。这些非致命性的变异可能赋予病毒更有效的复制优势，逃避宿主免疫，发展对药物的耐受性。这些HCV RNA基因组和多肽序列的变异可在单个HCV感染的个体内产生彼此密切相关、但又完全不同的病毒株，从而导致一个相当大的准种池(pool of quasispecies)[6]。根据HCV的核心区/E1区核苷酸序列31-33%的同源性，将HCV分为6种不同的基因型；遗传变异性（genetic variablity）最高的区域是E1、E2糖蛋白和NS5A区，而序列最保守的区域是NS3、NS5B、核心区和5’非翻译区(NTR)，每种基因型根据20-25%的核苷酸序列差异又分为不同的基因亚型，HCV基因型的重要性决定了HCV对干扰素和利巴韦林治疗的免疫应答率。在E2糖蛋白N末端第1-27位氨基酸发现高度变异的区域，称为高变区（High Variability Region, HVR1）。在不同的基因型、亚型、准种之间HVR1序列各不相同；三级结构分析显示HVR1三维结构存在巨大的差异；研究显示HVR1包含有中和抗体表位。在HCV慢性感染过程中，这些表位诱发的中和抗体亦发生巨大变化，提示HVR1变异是HCV在机体免疫压力作用下发生免疫逃避的机制之一。

　　由于NS5B蛋白的RNA依赖的RNA多聚酶缺乏校正功能，HCV RNA序列持续改变，其中突变率高达每年5×10-3/位点，每天有1012个病毒颗粒产生和清除。由于HCV RNA复制过程中的高变异率，使得HCV某些T细胞和B细胞表位的序列亦发生改变，在HCV自然感染过程中出现免疫逃逸。HCV表位抗原的变异及HCV遗传多样性为疫苗的发展提出了问题。基因型、亚型的多样性和病毒株的变异要求疫苗诱发的免疫必须涵盖HCV病毒6种不同的基因型。对HCV感染自发清除的患者血清研究发现体内存在针对不同HCV基因型的交叉反应中和抗体（cross-neutralizing antibody），这提示必须设计针对不同包膜蛋白的交叉反应疫苗。

　　HCV病毒可感染人和猩猩的肝细胞，目前发现的肝细胞表面HCV受体包括：CD81分子[7]、I型清道夫受体B（scavenger receptor class B type I）[8]、Claudin-1[9]、低密度脂蛋白受体[10]。最近研究显示小鼠肝细胞表面occludin受体[11]是HCV感染小鼠的重要受体。

　　目前对于HCV逃避宿主免疫的研究和HCV感染者宿主免疫自发恢复的研究使我们越来越清楚的认识到与保护性免疫有关的一些免疫特征。HCV感染自发免疫恢复的特征与多功能CD4+T细胞、基因型交叉的CD8+CTL和中和抗体相联系。这些研究有利于我们理解针对HCV感染的保护性免疫，也为发展HCV疫苗奠定了基础。我们将从HCV感染的病毒动力学和免疫逃避入手，对当前HCV预防性和治疗性疫苗的新进展作一综述。

　　2.      HCV原发感染和继发感染中的病毒动力学[12]

　　在HCV原发感染过程中，8-14周内发展成为急性丙型肝炎，此时血清转氨酶水平增高，肝脏中可检测到HCV特异性的T细胞。病毒复制在最初的1-2周成对数级增加，平均每半天增加1倍；此后病毒水平增加缓慢，平均7.5天增加1倍。伴随着ALT水平升高，病毒水平在8-14周内快速下降，此时可检测到HCV特异性的CD8+T细胞反应和肝内γ-IFN的表达，这和T细胞免疫反应有关。当HCV原发感染已发生免疫清除的大猩猩和患者再次感染HCV病毒后，尽管部分病例可转化为慢性感染，但但多数病例病毒复制的控制和清除的动力学与原发感染不同，原发感染诱导的适应性免疫（adaptive immunity）在继发感染后被进一步修饰，更快的清除HCV病毒感染。病毒动力学研究显示继发感染持续时间更短，明显减少了肝脏和外周血病毒水平，减少了肝脏的炎症。

　　3.      HCV的免疫逃避

　　HCV能够和免疫系统的效应蛋白发生相互作用，从而逃避免疫监视，最终导致感染慢性化。HCV能抑制α-IFN的产生、抑制NK细胞活性、产生逃避变异物免遭抗体和CD8+CTL的识别，所有这些都有助于HCV感染的慢性化。

　　许多RNA病毒在复制过程中产生的双链RNA能被宿主模式病原识别受体（pathogen-recognition receptors）如TLR3[13]、RIG-I[14]和MDA-5[15]识别，从而产生抗病毒反应。双链RNA作为配体和TLR3结合，激活了TLR3信号传导路。TLR3信号以MyD88依赖和MyD88独立（MyD88-dependent/independent pathway）的传导路传导信号。其中MyD88独立的传导路通过接头蛋白TRIF激活干扰素调节因子3（IFN Regulatory Factor-3, IRF-3），导致IRF-3磷酸化，同时发生细胞核定位。激活的IRF-3进入细胞核后作为转录因子，反式激活I型干扰素和其他参与宿主防御反应的蛋白的表达，从而达到免疫清除HCV的作用。因此，TLR3信号传导路中的TRIF蛋白具有重要作用。另外，RIG-I传导路通过Cardif接头蛋白激活I型干扰素的产生。但HCV病毒在进化过程中为了自身的生存，发展了一种机制参与了HCV的免疫逃避：HCV基因组中的NS3-4A作为一种蛋白酶在细胞内可水解TRIF和Cardif蛋白，这样就阻止了TLR3和RIG-I信号传导路，抑制了干扰素和其他参与宿主防御反应的蛋白的表达，导致HCV免疫清除的抑制，产生HCV感染的慢性化。

　　慢性HCV感染者体内I型干扰素缺乏导致NK细胞活性减少。通过炎性细胞因子如γ-IFN或抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC），活化的NK细胞是病毒感染天然免疫的重要效应细胞。I型干扰素活化DC细胞，随后引导NK细胞产生IL-15[16]。在慢性HCV感染者体内I型干扰素的缺乏导致血清中IL-15减少，这主要是由NK细胞总数减少，尤其是细胞毒作用的CD16+CD56DIMNK细胞减少[17]，从而影响体内HCV病毒的清除。

　　在HCV感染过程中，体液免疫所致的抗体反应不足以保护个体免遭HCV感染。中和抗体在急性HCV感染者体内很少发现，但在慢性感染者体内抗HCV抗体的滴度甚高，中和抗体难以控制HCV感染可能与下列机制有关[18]。HCV能够连接到极低密度脂蛋白，有利于肝细胞摄入HCV病毒，通过和载脂蛋白B和I型清道夫受体B相互作用[19]，有助于避免HCV病毒被中和抗体识别。HCV的包膜蛋白E2能够被糖基化（glycosylation）[20]，其糖基化位点在所有HCV基因型和亚型中具有保守性，E2区CD81连接位点的三个氨基酸糖基化后降低了病毒的免疫原性，保护病毒免遭抗体的中和。

　　HCV病毒也可通过CD81和Claudin-1介导的细胞-细胞直接相互作用直接感染周围细胞，免遭中和抗体的清除。HCV也可在体内产生不同的准种（quasispecies）[21]，所谓准种，即是一组自身复制的分子，它们彼此不同，但又密切相关。准种的演变是从一个原始的特定病毒序列开始的，该病毒的每一轮复制均导致变异株的出现。因此，在任何时间点，某病毒群（viral population）总是由常见的代表性序列即主序列（master sequence）和同一组不同的但又密切相关的序列（变异株）所组成。所有这些相关的序列（变异株），不管其所占比例如何，均被认为是一群复制体（replicon）,表现为动态的遗传相互作用（dynamic genetic interaction）。当环境发生改变时，在原病毒群中已存在的各种变异株，以及在复制过程中新生代的变异株，将被选择出最适应于新环境的变异株。尔后，被选择出的变异株又面临新环境的变化。为了其子代能继续复制，将再次被选择出适应新环境的变异株。如此周而复始，不断形成新的病毒群（即准种）。在单个慢性HCV感染者体内证实存在多种不同的HCV准种，在不同HCV基因型或亚型的刺激下，机体免疫系统产生多种相应的中和抗体，但这些中和抗体不能中和体内主要的HCV病毒株。因此，抗体反应不能解决HCV感染。而且，干扰抗体的存在能够减少真正中和抗体的功能[22]。在HCV病毒E2区存在2个重要的表位[22]，表位I定位于E2区412-426位氨基酸残基，是重要的中和抗体作用位点，在不同的HCV基因型中具有保守性；表位II定位于E2区434-446位氨基酸残基，该表位在HCV基因型中变异率高，产生的抗体干扰表位I诱导产生的抗体。对这两个表位诱导产生的特异性抗体分析显示慢性HCV感染者优先产生无保护作用的表位II抗体；表位I诱导产生的抗体出现得很晚，且有相同丰度的表位II抗体同时产生。当表位II抗体从血浆中清除后，血浆中仅含有表位I抗体，能够对不同的HCV基因型产生良好的中和能力。在HCV的免疫逃避机制中，除HCV基因组本身的变异外，干扰抗体的产生也是其机制之一[22]。因此，能够有效诱导表位I特异性抗体产生的HCV疫苗也是将来HCV疫苗研究的方向。

　　CD8+T细胞识别表位的逃逸性变异要求在病毒感染性和宿主免疫反应之间寻求平衡。NS5B是HCV复制过程中RNA依赖的RNA多聚酶，在HCV复制过程中具有低保真性，是HCV慢性感染者体内病毒准种出现的原因。HCV基因组序列变异的积累从机体对HCV病毒产生免疫压力即已开始。对CD8+T细胞识别表位的变异分析显示：该表位氨基酸变异的速度较其他区域更快；在慢性感染期CD4+T细胞的缺乏阻止CD8+CTL清除HCV病毒。HCV特异的CD8+CTL不能完全控制HCV病毒血症与CD8+T细胞识别表位的逃逸性变异具有相关性，这些无效的CD8+CTL对HCV病毒的变异提供了选择性免疫压力。

　　4. HCV的保护性免疫

　　尽管宿主免疫系统不能有效的根除HCV病毒，但对自发清除HCV感染的患者的研究使我们发现体内存在某些与HCV免疫清除有关的保护性免疫机制。有些报道显示HCV的清除与宿主遗传背景有关，如宿主HLA型别[23]、细胞因子IL-10[24]和IL-28、化学因子如CCR5的表达[25]。HCV的清除和患者的HLA-B27[23]等位基因有关；因为MHC-I类分子如HLA-B27与将抗原提呈给CD8+CTL有关，因此有效的MHC-I类分子对CD8+CTL清除病毒具有重要作用。在HCV感染的免疫控制过程中，CD8+CTL是重要的效应细胞，这种观点首先是在分析大猩猩急性HCV感染过程中发现的。研究显示在大猩猩感染HCV病毒后，少数猩猩可自发清除体内的病毒，而大多数转变为HCV慢性感染，比较这两组猩猩体内中和抗体和CD8+CTL的发生发展，自发清除组显示对多种不同的病毒表位、经多种不同的MHC-I类分子抗原提呈后发生强烈的CD8+CTL清除病毒反应。自发清除HCV病毒的大猩猩使用HCV病毒进行第二次免疫刺激，第一次免疫清除需要40天，而第二次免疫清除仅需要14天；特异性CD8+CTL数量和HCV病毒载量成负相关。在使用HCV病毒进行第三次免疫刺激前耗竭特异性CD8+CTL，HCV感染的时间会延长。HCV慢性感染者体内缺乏针对HCV不同抗原表位的CD8+CTL的广泛的特异性和细胞毒作用。对HCV感染自发清除和慢性感染者体内CD8+CTL的进一步研究，通过检测HCV表位刺激后产生的γ-IFN水平，自发清除感染者体内具有强烈的CD8+CTL反应和针对HCV不同抗原表位的CD8+CTL。这种特异性CD8+CTL对抗原表位刺激具有强烈的增殖活性，表达记忆性的CCR7hi CD45RAlow CD27+CD28+表型[26]；在HCV感染自发清除患者的CD8+CTL细胞表面发现IL-7受体的表达。另外，对HCV不同基因型发生交叉免疫反应的CD8+CTL细胞限制了HCV的免疫逃逸，促进了病毒的免疫清除。因此，针对HCV不同抗原表位、对HCV不同基因型发生交叉免疫反应的CD8+CTL细胞是HCV感染过程中发生免疫清除的重要条件。

　　在HCV感染自发清除患者中，具有广泛特异性和功能的CD4+T细胞在HCV感染的清除过程中具有重要作用。CD4+T辅助细胞参与激活适应性免疫反应（adaptive immunity），尽管CD8+CTL在控制HCV感染中具有重要作用，但在某些HCV慢性感染者体内仍存在具有高度特异性的CD8+CTL，但这些CD8+CTL不能有效清除HCV病毒，研究显示自发清除和慢性感染者的区别处决于CD4+T细胞的反应。研究发现自发清除者体内CD4+T细胞能特异性识别多种不同的HCV抗原表位，而慢性感染者不具有这种功能。对慢性HCV感染患者的干扰素治疗研究发现具备分泌IL-2和γ-IFN的CD4+T细胞和病毒的清除具有相关性；当CD4+T细胞不能分泌IL-2时HCV感染就转变为慢性化。因此，分泌IL-2和γ-IFN的多功能CD4+T细胞是产生高度特异性的CD8+CTL的关键因素。

　　尽管中和抗体对HCV感染普遍缺乏保护，但对HCV基因型具有交叉反应的中和抗体似乎具有保护作用。HCV感染个体可诱导对HCV的核心区、NS3、NS4和NS5蛋白的中和抗体。目前研究显示中和抗体的检测可通过HCV假型颗粒（pseudotype particles, HCVpp）表达的E1和E2蛋白来进行[27]，因为E1和E2蛋白存在于HCV病毒颗粒的表面，在病毒颗粒进入肝细胞过程中发挥关键作用，E1和E2蛋白诱发的特异性抗体具有中和能力。来源于HCV感染者体内的单抗证实针对E1和E2蛋白的特异性抗体对HCVpp具有基因型交叉中和能力。当人源化小鼠感染HCV病毒后，E1和E2蛋白的特异性抗体对小鼠提供积极的保护作用，阻止病毒在小鼠体内复制。对吸毒感染HCV后自发清除的瘾君子研究显示，这些感染者体内广泛的中和抗体对清除体内的HCV病毒具有重要作用；当这些瘾君子再次感染HCV病毒后，83%的感染者能自发的清除病毒。对这些人体内中和抗体分析显示，和HCV慢性感染的吸毒者相比，自发清除者体内中和抗体能和多种不同基因型的HCV发生中和作用。

　　干扰素和利巴韦林联合应用于治疗慢丙肝感染者，对其作用机制的研究显示天然免疫（innate immunity）在HCV病毒清除过程中具有重要作用。基因组学相关性研究证实在IL-28B基因的表达在HCV的干扰素免疫清除中具有重要作用[28]。IL-28B基因编码IFN-3λ蛋白，后者在干扰素联合利巴韦林的免疫应答中发挥重要作用；不同人群IL-28B基因上游启动子基因多态性和干扰素的持续免疫应答有关；这种基因多态性也和HCV病毒的自发免疫清除有关。来至不同地区的人群基因比较发现，C等位基因（rs12979860）的SNP改变通常发生在亚洲和欧洲人群中，在非洲人群中最少；36.4%的亚欧人群和9.3%的非洲人群可自发清除HCV病毒，这进一步证实C等位基因的SNP改变在HCV免疫清除过程中的重要性。IFN-3λ联合IFN-1λ（IL-29）、IFN-2λ作用于包含IL-28Rα和IL-10Rβ的受体复合物，激活JAK-STAT信号传导路，类似于I型干扰素抗病毒作用。尽管IFN-3λ在抗HCV的功能未完全弄清楚，但研究显示IFN-λ在肝癌细胞系Huh7.5中具有抑制HCV复制的作用；另外，IFN-λ能增强a-IFN的抗病毒活性。

　　5. 宿主免疫反应模型系统的研究进展

　　长期以来，由于缺乏有效的体外HCV复制和感染模型系统，使得HCV 中和抗体的特征、HCV变异物（HCV variants）逃避细胞免疫和体液免疫的机制研究长期停滞不前。在2003年，用HCV包膜糖蛋白构建的假型病毒颗粒HCVpp第一次用于研究HCV病毒的细胞进入和抗体介导的中和作用[27]。假型病毒 (Pseudotyped virus)是指病毒颗粒的结构蛋白(多为包膜蛋白)不是由其本身携带的基因编码，而是由另一种病毒编码。假型病毒的细胞嗜性和感染过程与真病毒相似，可以模拟病毒感染的早期过程。

　　Codran A等[29]构建带有HCV包膜蛋白E1、E2的假型病毒VSV/HCV，证明了只有E1、E2共表达时此假型病毒才能进入细胞。利用带有丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白的人免疫缺陷病毒的假型病毒，感染人的肝癌细胞系，发现此感染过程可以被可溶性形式的CD81和CD81的特异性单克隆抗体所阻断，说明CD81是HCV受体的一个组成部分。Lagging L. M.等[30]用HCV DNA疫苗免疫接种Balb/c小鼠后，可以诱导小鼠产生强烈的体液免疫应答。将HCV的E1(174 aa～359 aa)和E2(371 aa～742 aa)区与疱疹病毒G蛋白的跨膜区和胞质尾区构建成嵌合基因，即VSV/HCV假型病毒；然后用同源性HCV分离株的包膜蛋白免疫黑猩猩后获得血清，在体外进行中和试验，发现VSV/HCV假型病毒不能感染真核细胞，提示E1和E2在假型病毒感染真核细胞中起着重要作用，用此嵌合基因免疫小鼠后产生的抗体，可作为潜在的中和抗体为探索HCV疫苗提供一种新途径。

　　 2005年，Wakita及其同事构建了HCV 2a型全长复制子JFH-1,在此基础上一种新的 HCV体外细胞培养系统HCVcc(cell-culture derived HCV，HCVcc) 构建成功。通过将体外转录的 HCV JFH-1复制子基因组全长 RNA转染细胞，在不需适应性突变就能在体外培养的肝癌细胞系 Huh-7细胞中有效复制，并包装出具有感染性的HCV病毒颗粒。该系统使得体外研究HCV的完整病毒复制周期和病毒-宿主相互作用成为可能；这个系统也可用于研究HCV抗体介导的中和作用和病毒免疫逃避的分子生物学机制。

　　6. 发展B细胞疫苗存在的问题：抗体中和作用的病毒学逃

　　目前两个HCV急性感染的队列研究揭示了体内中和抗体的快速诱导和病毒清除之间具有相关性。在清除HCV病毒的患者体内很快检测到高低度的交叉中和抗体（cross-neutralizing antibodies）；相反，在发展成为慢性感染者体内中和抗体的诱导推迟，且这些抗体不能用于控制HCV感染。von Hahn等[31]研究显示宿主诱发的中和抗体种类和数量远远落后于HCV病毒准种产生的包膜糖蛋白的序列种类，这个机制解释了为什么慢丙肝患者体内中和抗体不能控制HCV的感染。对肝移植患者的研究证实抗体介导中和反应的逃避是HCV病毒重新感染移植肝脏的重要机制。

　　如果单克隆或多克隆抗体能中和不断变化的HCV病毒，至少要能识别HCV胞膜糖蛋白不连续的抗原表位。最近的研究发现在HCV病毒感染者体内中和抗体反应可阻止病毒感染肝细胞，即可能阻止了HCV-CD81、HCV-SR-BI的相互作用，同时阻止了病毒的胞膜融合。交叉抗体中和不同的HCV抗原表位可能干预HCV病毒进入细胞的不同步骤，从而达到清除HCV病毒感染的目的，这为将来发展有效的B细胞疫苗提供了思路。

　　除了HCV病毒的高度变异性之外，HCV还可通过其他机制逃避中和抗体反应：诱导其他抗体干扰中和抗体反应；HCV病毒颗粒与低密度脂蛋白和及低密度脂蛋白的相互作用，降低中和抗体的识别；HCV包膜糖蛋白与高密度脂蛋白和SR-BI的相互作用[32]；包膜糖蛋白中和表位特定氨基酸糖基化掩盖了中和抗体的识别；直接的细胞-细胞的病毒感染，中和抗体不能识别胞内病毒。多种不同的逃避机制共同作用导致中和抗体在体内不能有效地清除HCV感染，导致HCV感染慢性化。

　　上述研究阐明了中和抗体免疫逃避的分子机制，这为开发以抗体为基础的治疗方法和建立有效地B细胞疫苗提供了基础。B细胞疫苗开发的主要挑战是在不同的HCV基因型、亚型中发现共同的保守序列，后者可诱导产生具有交叉免疫反应的中和抗体，在HCV感染靶细胞前中和HCV病毒，对机体起保护作用。目前有文献报道：在使用HCV病毒感染人类肝脏合小鼠研究证实中和不同HCV基因型病毒的中和抗体可保护肝脏免受HCV病毒的侵袭，这些研究也许为进一步发展有效的B细胞预防疫苗（prophylactic vaccine）提供了可能。

　　7. T细胞免疫反应和病毒感染的控制

　　在人体和大猩猩的研究证实急性HCV感染的自限性过程与针对HCV不同靶位的CD4+T和CD8+T细胞的持续免疫反应有关。在HCV感染的自发清除后记忆性T细胞可保持数十年，当HCV病毒再次感染后能介导保护性免疫。当HCV病毒再次感染后，病毒复制的快速抑制与早期诱导HCV特异的、记忆性的CD4+T和CD8+T细胞免疫反应有关。也有报道显示：某些大猩猩既往曾对HCV产生保护性免疫应答，但在HCV多次进行免疫刺激后出现感染慢性化，这些研究提示对HCV病毒的保护性免疫需进一步研究。

　　与HCV病毒彻底免疫清除的急性感染不同，HCV感染的慢性化仅发现微弱的CD4+T细胞反应。Urbani等[33]研究显示在HCV病毒急性感染发生免疫清除过程中，机体免疫系统诱发强烈、广泛的CD4+Th细胞免疫反应；在HCV感染慢性化过程中，不但CD4+T细胞反应受损，而且CD8+T细胞反应非常微弱；只有那些能够完全控制HCV感染的患者才能诱导成熟的CD8+T细胞。因此，良好的CD8+T细胞免疫反应可降低HCV感染慢性化的发生率。功能CD4+T细胞免疫反应决定了HCV感染的最终后果，即直接控制病毒或促进保护性的记忆CD8+T细胞的成熟。HCV感染慢性化的另一个重要机制是病毒逃避CD8+T细胞的免疫反应；在人体和大猩猩的研究显示CD8+T细胞识别的、HLA-I类分子限制的抗原表位的变异发生于HCV感染早期，与HCV感染的慢性化有关。在偶然感染HCV病毒的爱尔兰妇女研究显示HLA-I类分子等位基因A3、B27、Cw*01与HCV病毒感染的迅速清除有关；等位基因B8和病毒感染慢性化有关，这提示宿主遗传背景是影响HCV病毒感染转归的重要因素。另外，病毒变异所致的CD8+T细胞免疫逃避和病毒的适应性（viral fitness）有关；免疫逃避变异稳定的整合到病毒基因组的后果尚不明了，但人群中常见的MHC-I类分子识别的表位可能逐渐逐渐丧失或退居次要位置，这些结果影响到疫苗的发展。

　　在HCV感染慢性化阶段可检测到病毒特异性的CD4+T和CD8+T细胞免疫反应，但这些免疫反应不足以彻底清除病毒，对其机制的研究有利于开发有效地治疗性疫苗。从HCV慢性感染者体内分离的特异性CD4+T和CD8+T细胞通常发现功能性或成熟缺陷，如减少的细胞毒潜力、Th1型细胞因子分泌减少、在外源性抗原刺激下细胞增殖能力下降。HCV感染慢性化涉及不同的机制，如HCV病毒特异性的T细胞免疫反应被调节性T细胞（regulatory T cells, Treg）[34]或程序性死亡受体1（programmed death receptor 1, PD-1）[35]下调。和HCV病毒彻底免疫清除的急性感染相比，在HCV感染慢性化患者中Treg细胞频率明显增加。但在黑猩猩体内研究显示：在HCV感染慢性化和免疫清除组中Treg细胞频率和免疫抑制程度无明显差异。通过T细胞表面PD-1介导的HCV病毒特异性的T细胞免疫反应的下调和病毒特异性的T细胞功能缺陷有关。最近的研究证实在HCV慢性感染者体内病毒特异性CD8+T细胞表面高表达PD-1蛋白；此类CD8+T细胞表达的γ-IFN水平减少，体外抗原刺激后增殖能力明显降低，在HCV感染过程中呈现出免疫抑制的特征。

　　总而言之，HCV感染的后果受多种不同因素的调节：免疫因子的相互作用、宿主遗传背景、病毒因素（病毒变异后免疫逃避）。因此，开发预防性和治疗性疫苗受到下列方面的挑战：1. 是否可开发一种有效地疫苗同时针对不同的HCV基因型和准种。2. 尽管对HCV特异性T细胞免疫的了解并不充分，我们是否可设计出诱导广泛T细胞免疫的的疫苗？3. 疫苗诱导的记忆性CD4+T和CD8+T细胞免疫是否可长期维持？治疗性疫苗的设计不但要克服慢性HCV感染者体内T细胞免疫反应的损伤或抑制状态，而且要确保疫苗诱导的免疫功能对机体不构成免疫病理损害。

　　8. HCV疫苗开发的方法

　　HCV多肽疫苗是最早设计的、旨在诱导慢性HCV感染者体内CD4+T和CD8+T细胞免疫反应的疫苗，研究资料显示多肽疫苗具有良好的耐受性，但疗效仍有待进一步优化。

　　由病毒载体携带的HCV能够诱导有效的CD4+T和CD8+T细胞免疫反应，修饰的Ankara病毒MVA可作为疫苗载体，这种病毒基因组中缺乏编码免疫调制蛋白的基因，在体内具有免疫原性，可诱发安全的免疫反应，这种修饰病毒已用于HIV、结核等疫苗的设计。MVA载体疫苗诱导的免疫具有强烈的抗载体免疫反应，但这种免疫反应对载体携带的靶抗原诱导的免疫反应无影响。HCV的MVA载体疫苗包括携带NS3、NS4和NS5B基因，这些重组载体可诱导分泌γ-IFN的CD4+T细胞和特异性的CD8+T细胞，促进HCV病毒的清除。15名慢性感染者接受这种载体疫苗治疗3周耐受性良好，6个病人出现分泌γ-IFN的CD4+T细胞增加，病毒水平下降。

　　HCV的DNA疫苗已经被设计用于治疗慢性HCV感染。由于慢性感染者体内HCV病毒亚型的异质性，DNA疫苗的设计包括NS3和NS4A蛋白的所有的保守区。通过对DNA疫苗靶序列广泛的密码修饰，DNA能在细胞内有效表达并诱导CD4+Th1和CD8+T细胞免疫反应，这些诱发的CD8+T细胞能显著减少表达NS3和NS4A蛋白的肝细胞，即通过主动免疫诱导后清除了感染HCV的肝细胞。这种DNA疫苗用于治疗12名慢丙肝感染者，结果显示其具有较高的安全性，其免疫原性至少可维持4个月以上。在完成免疫接种后，其中3名患者接受正规的干扰素和利巴韦林的治疗，HCV病毒载量被加速清除。因此，推测DNA疫苗可以和干扰素联合用于治疗慢丙肝的感染。

　　对急性HCV感染的保护性免疫研究证实识别广谱病毒表位的CD4+T细胞功能的重要性。在这些多功能CD4+T细胞帮助下，机体免疫系统可产生功能性的CD8+T细胞清除HCV病毒感染的肝细胞，同时产生中和抗体阻止病毒进入正常肝细胞，理想的疫苗要满足上述免疫学特点。

　　9. 预防性疫苗

　　Chiron研究小组[36]进行了诱发中和抗体的预防性疫苗的研究，它们开发了HCV胞膜糖蛋白E1/E2疫苗，主动免疫诱发HCV特异性的中和抗体和T细胞免疫反应。使用这种疫苗接种大猩猩的研究证实体内获得高滴度的中和抗体，诱导产生强烈的体液免疫反应。这种免疫反应有助于病毒的清除。Forns等[37]使用E1/E2预防性疫苗免疫大猩猩诱导特异性的抗胞膜蛋白E1/E2抗体，且高滴度的中和抗体反应和病毒的清除具有相关性。这些试验证实E1/E2胞膜蛋白的预防性疫苗诱导的中和抗体联合T细胞反应可预防HCV感染，促进病毒的清除。尽管E1和E2区发现许多中和表位，这些表位多肽免疫大猩猩也产生许多中和抗体，但这些预防性疫苗诱发的体液免疫是否可长期维持、什么水平的中和抗体滴度有助于清除病毒感染仍需进一步研究。

　　诱导中和抗体的预防性疫苗开发的最大挑战是使用特定的抗原表位进行免疫是否可产生异源性保护作用，即对其他基因型的HCV是否具有交叉保护作用。有报道显示E2区保守的中和表位可诱导产生中和抗体，在中和表位临近的表位可诱导产生干扰抗体，只有这些干扰抗体被封闭后，中和抗体才能发挥真正的抗病毒作用。这种新观点现用于E1/E2蛋白的预防性疫苗的研制，只有将具有免疫原性、但又不能作为中和表位的多肽序列从重组E1/E2疫苗中删除，才能诱导交叉中和免疫反应。诱导中和抗体的预防性疫苗的进一步研究包括：分析疫苗诱发的中和抗体谱，明确那种抗体可用于中和反应，那种抗体具有免疫原性但不具有中和能力。

　　因为T细胞免疫在HCV病毒的免疫清除中具有重要作用，因此HCV预防性疫苗的开发主要集中构建T细胞免疫疫苗。目前报道了许多方法用于这种疫苗的构建：如构建HCV病毒样颗粒（HCV virus-like particles）、缺陷病毒为载体的DNA疫苗等。HCV病毒样颗粒能成功的诱导HCV特异的细胞免疫反应，但不会诱导产生中和抗体。此类预防性疫苗在黑猩猩体内可诱导HCV特异的细胞免疫反应，可预防HCV感染，控制HCV病毒复制。诱导HCV特异的T细胞可分泌γ-IFN和其他细胞因子。但研究显示这种T细胞预防性疫苗不能用于治疗HCV慢性感染。下一代T细胞疫苗的研究要着重分析保护性的T细胞表型和功能标记物、效应细胞记忆表型、T辅助细胞功能和效应细胞增殖标记物。

　　10. 治疗性疫苗

　　几个研究团队开发了HCV治疗性疫苗，治疗性疫苗的目标旨在诱导HCV特异性的细胞免疫反应，修正慢丙肝感染者体内业已存在的T细胞功能缺陷。目前，几种不同的HCV治疗性疫苗已用于临床试验。在使用重组胞膜蛋白E1的治疗性免疫试验中，35名慢丙肝患者随机肌注20ug重组E1蛋白进行免疫或安慰剂，然后34名患者接受真正的E1治疗性疫苗，进行了6剂、共两个疗程的免疫接种后发现患者的耐受性较好，绝大多数患者诱导了强烈的、特异性的体液和细胞免疫。24名患者在接种免疫17个月后进行了肝穿活检，9名患者肝组织病理结构改善，10名患者病理结构较治疗前未见改变，5人出现肝脏病理结构恶化。在治疗过程中，尽管肝脏转氨酶水平呈下降趋势，但血清HCV-RNA水平保持不变；这种治疗性疫苗对血清HCV-RNA水平和肝脏组织学结构影响的大规模研究仍需进一步研究。

　　另外一种治疗性疫苗IC41包含7个HCV相关T细胞表位的合成多肽疫苗，使用辅助性T细胞特异的多聚L型精氨酸为佐剂，62名慢丙肝患者对干扰素治疗无效或复发，它们的主要组织相容性抗原为HLA-A2亚型，将这些患者随机分为5组，其中3组分别接受不同浓度的IC41免疫，另外1组仅接受HCV相关多肽的免疫，最后1组多聚L型精氨酸佐剂的刺激，研究证实尽管HCV病毒血症持续存在，但IC41疫苗诱导产生HCV特异的Th细胞反应；因为强烈的Th细胞反应是免疫清除HCV病毒的基础，因此在这些干扰素正规治疗无效或复发的患者中使用IC41疫苗联合干扰素治疗HCV感染是慢丙肝患者抗病毒治疗的一个研究方向。这两种治疗性疫苗的局限性在于：疫苗的构建仅基于单一的抗原，即胞膜蛋白E1；有限的T细胞抗原表位诱发的免疫要面对HCV的高度变异性；而且必须和干扰素抗病毒治疗联用。使用MVA构建的治疗性疫苗TG4040可表达NS3、NS4和NS5B蛋白，在体内可诱导HCV特异性的T细胞免疫。研究显示TG4040具有良好的安全性和耐受性，似乎对病毒水平也有一定的抑制作用。

　　对HCV 1b亚型干扰素治疗失败的慢丙肝患者的个性化多肽疫苗临床实验在日本的一个研究小组进行，该小组评估了个性化的HCV 1b病毒来源的多肽疫苗的安全性和有效性，研究证实在第14次免疫接种后，在12名实验者中，5名实验者出现ALT下降，3名出现HCV RNA水平下降。这种个性化疫苗主动免疫产生的病毒清除作用在慢丙肝治疗中是否具有普适性仍需进一步研究。

　　11．小结

　　当前绝大多数HCV疫苗的开发基于提高HCV细胞免疫水平，但目前对HCV病毒免疫的理解认为：一个有效的HCV疫苗不但要能诱发针对不同HCV基因型、亚型的中和抗体，还要诱发广谱的细胞免疫反应。病毒的高变异性和免疫逃避机制的发现使得抗原的选择变得更加困难；要求在HCV氨基酸序列中寻找保守的T细胞和中和抗体表位。疫苗研究的目标是寻找HCV病毒复制周期的最佳作用靶点及如何规避免疫逃避机制。另外，还要发展有效的抗原提呈系统，后者在慢丙肝患者中往往出现免疫缺陷或损伤。一个有效的HCV疫苗不但能阻止HCV病毒感染，还可阻止HCV病毒诱导的终末期肝病如肝硬化和肝癌的发生。

　　今后HCV疫苗的开发将从下列几个方面着手：发现高度保守的表位和交叉中和抗体；更好的理解HCV感染慢性化的机制：免疫逃避机制、DC细胞-T细胞的相互作用、免疫耐受状态研究、异常免疫机制的研究、HCV与脂质的相互作用。

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　　（北京地坛医院 肖江）