汉族人低密度脂蛋白受体基因多态性对血脂、脂蛋白和载脂蛋白水平的影响

 　　研究表明，低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDL-R)基因多态性影响血脂水平，已有报道LDL-R基因PvuⅡ、StuⅠ位点多态性影响正常人血脂水平［1］，HinⅡ位点多态性影响糖尿病患者脂代谢［2］。最近Ahn等［3］发现LDL-R基因外显子18 NcoⅠ位点多态性与总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平有关。我们应用聚合酶反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术，研究了NcoⅠ位点多态性对汉族人血脂、脂蛋白和载脂蛋白水平的影响。

　　1　研究对象和方法

　　1.1　研究对象　正常血脂组81名，随机选自体检健康者，男44名，女37名，年龄50±16岁，TC＜5.20 mmol/L、甘油三酯(TG)＜1.70 mmol/L、LDL-C＜3.12 mmol/L、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)＞1.04 mmol/L、脂蛋白(a)［Lp(a)］＜100 mg/dl。高脂血症组51例，男23例，女28例，年龄56±18岁，TC＞5.72 mmol/L、TG＞1.70 mmol/L、LDL-C＞3.64 mmol/L、Lp(a)＞100 mg/dl。以上均为无血缘关系的湖北地区汉族人，排除肝、肾、内分泌等影响脂质代谢的疾病。

　　1.2　试剂和主要仪器　限制性内切酶NcoⅠ、TaqPlusⅠ DNA聚合酶(MBI公司)。4种dNTP、λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ Markers(华美公司)。DNA扩增仪(PE2400型)，岛津CL-7200全自动生化分析仪。

　　1.3　方法

　　1.3.1　引物设计与合成　参照文献［3］设计，序列为：P1：5′-TCCGCTGTTTACCATTAGTTGGCAG-3′；P2：5′-GTTGC-ACACAGTCCAGTACGTGCAA-3′。

　　1.3.2　模板DNA的提取　用改良NaⅠ法。

　　1.3.3　PCR-RFLP　反应总体系50 μl，10×buffer 5 μl，dNTP 200 μmol/L，P1、P2各0.3 μmol/L，0.5 μg基因组DNA，Taq PlusⅠ DNA聚合酶2U。将反应物置95℃预变性5 min，取出加入Taq PlusⅠDNA聚合酶2U。按95℃变性1 min(或95℃变性30 s或95℃变性15 s)，70℃延伸3 min，循环30次。末次循环后延伸5 min。取10 μl PCR扩增产物，加入10 U限制性内切酶NcoⅠ，10×buffer 2 μl，无菌双蒸水7 μl，37℃消化过夜。酶切产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

　　1.3.4　血脂及载脂蛋白的测定　酶法测定TC和TG；选择遮蔽直接测定法测定HDL-C；直接测定法测定LDL-C；双波长免疫透射比浊法测定ApoAⅠ、ApoB及Lp(a)。

　　1.4　统计学处理　研究对象与Hardy-Weinberg平衡符合的程度，组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验；组间血脂水平比较采用F检验。

　　2　结果

　　2.1　限制性片段长度多态性分析　LDL-R基因外显子18扩增片段为2490 bp，酶切后片段有3种，为2490 bp、1570 bp和920 bp。若有NcoⅠ酶切位点，可见1570 bp和920 bp的带［等位基因NcoⅠ(+)］；若无NcoⅠ酶切位点，只见1条2490 bp的带［等位基因NcoⅠ(-)］。则基因型有3种：NcoⅠ(-/-)、NcoⅠ(+/-)和NcoⅠ(+/+)型(图1)。

　　2.2　LDL-R基因型多态型分析　比较血脂正常者和高脂血症患者基因型和等位基因频率(表1)，结果无显著性差异(P＞0.05)。

　　2.3　LDL-R基因NcoⅠ多态性与血清脂质水平的关系　正常血脂组，TC、LDL-C、TG、ApoB在NcoⅠ(-/-)、NcoⅠ(+/-)、NcoⅠ(+/+)基因型个体中有渐升趋势，且有显著性差异(表2)。高脂血症组，TC、LDL-C也有渐升趋势，但无显著性差异(表3)。

表1　正常人与高脂血症患者LDL-R基因NcoⅠ基因型分布及等位基因频率的比较

组别 例数 基因型分布 等位基因频率
-/- +/- +/+ - +
对照组 81 11(0.136) 42(0.519) 28(0.346) 64(0.395) 98(0.605)
高脂血症组 51 　8(0.157) 22(0.431) 21(0.412) 38(0.373) 64(0.627)

　　注：研究对象群体符合Hardy-Weinberg遗传平衡(正常人χ2=0.76,P＞0.05，高脂血症患者χ2=0.20,P＞0.05)

表2　正常人LDL-R基因型与血清脂质的关系(x±s)

基因型 例

　　数
 血脂* 脂蛋白 载脂蛋白
TC TG Lp(a)△△ HDL-C* LDL-C* ApoAI△ ApoB△ AI/B
-/- 11 3.72±0.71 1.05±0.49 14.06±1.97 1.28±0.28 1.92±0.67 1.23±0.05 0.81±0.17 1.57±0.33
+/- 42 4.02±0.65 1.02±0.44 15.31±1.89 1.16±0.30 2.32±0.61 1.26±0.09 0.89±0.19 1.48±0.39
+/+ 28 4.44±0.72 1.31±0.50 16.71±1.92 1.23±0.38 2.68±0.61 1.26±0.09 1.00±0.19 1.35±0.24
F值 　 5.46 3.32 0.31 0.80 6.42 0.66 3.21 2.22
P值 　 ＜0.01 ＜0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.05 ＞0.05

　　*：mol/L; △:g/L;△△:mg/dl

表3　高脂血症患者Nco Ⅰ基因型与血清脂质的关系(x±s)

基因型 例

　　数
 血脂* 脂蛋白 载脂蛋白
TC TG Lp(a)△△ HDL-C* LDL-C* ApoAI△ ApoB△ AI/B
-/- 8 6.41±0.49 2.80±1.84 15.56±5.08 1.22±0.47 4.05±1.37 1.33±0.18 1.27±0.21 1.06±0.21
+/- 22 6.57±0.67 2.18±1.02 20.42±2.06 1.26±0.36 4.57±0.84 1.22±0.25 1.25±0.25 1.01±0.27
+/+ 21 7.09±0.97 2.09±0.95 15.38±1.89 1.16±0.31 4.58±1.51 1.38±0.46 1.41±0.39 1.04±0.38
F值 　 3.17 1.28 1.02 0.40 0.61 1.11 1.43 0.12
P值 　 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

　　*: mmol/L; △:g/l; △△:mg/dl3　讨论

　　我们的研究发现，LDL-R基因NcoⅠ酶切多态性对正常人群TC、TG、LDL-C、ApoB水平有显著影响，TC、LDL-C相对NcoⅠ基因型由“-/-”、“+/-”向“+/+”型变化呈递增的趋势。此趋势在正常血脂组中有统计学意义，在高脂血症组中无统计学意义，可能是样本例数不够大的原因，但却表明LDL-R基因的多态性会影响正常人群的血脂水平。

　　基金项目：湖北省科技攻关重点课题资助项目(961P2002)

　　参考文献

　　［1］范乐明，蔡海江，姜传仓，等.低密度脂蛋白基因多态性及其与血清胆固醇水平的关系.中华医学杂志，1993，73(4)∶242-244.

　　［2］吴松华，王延庆，孙多奇，等.Ⅱ型糖尿病患者低密度脂蛋白受体酶切多态性的观察.中华医学杂志，1993，73(1)∶10-13.

　　［3］Ahn YI, Kamboh Ilyas M, Aston CE, et al. Role of common genetic polymorphisms in the LDL receptor gene in affecting plasma cholesterol levels in the general population. Arterioscler Thromb, 1995, 4(5)∶633-637.