聚合酶链反应-单链构象多态性分析在家族性高胆固醇血症患者家系调查中的应用

　　【摘要】　目的　探讨聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerase chain reaction-single strain conformation polymorphism, PCR-SSCP)在家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemiac, FH)患者家系分析中的应用价值。方法　对于经PCR-SSCP筛查、DNA序列分析证实的4例FH患者(1例纯合子FH外显子7发生点突变，1例杂合子点突变位于外显子14，2例杂合子点突变位于外显子4的3′部分)，用PCR-SSCP分析各家系成员共23例，并对基因型和表型进行比较。结果　各家系成员均从基因水平明确了诊断，23例个体中，除先证者外，还发现1例纯合子，8例杂合子。结论　PCR-SSCP可对FH先证者家系进行分析，并对其家系成员早期诊断，以便提供咨询和指导。

The application of polymerase chain reaction-single strain conformation polymorphism in the pedigree analysis of familial hypercholerolemia patients*

ZHU Daming　CHEN Zaijia　LU Zongliang　KOU Wenrong　XU Yishu　SUN Giliang

　　YANG Yuejin　CHEN Jilin　GAO Runlin　XU Haiyan

　　(Department of Coronary Heart Disease, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing, 100037 P.R. China. E-mail: chen. zaij@263.net)

　　CHEN Baosheng　LUXinyue　ZENG Wuwei

　　(Department of Basic Medical Institute, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College);

　　DU Huaiming　MA Xiancheng

　　(Department of Pediatrics, The Affiliated Hospital, Tianjin Medical University)

　　【Abstract】　Objective　To discuss the value of polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) in the pedigree analysis of familial hypercholesterolemia(FH) patients. MethodsFor 4 patients with FH detected by PCR-SSCP and DNA sequence analysis (1 homozygote has point mutation in exon 7, 1 heterozygote in exon 14,and 2 heterozygotes in 3′ part of exon 4 ),members of each pedigree, altogether 23 individuals,were analysed using PCR-SSCP. Results　Every member of the 4 pedigrees was examined genetically. Besides the 4 probands, another 1 homozygote and 8 heterozygotes were found. Conclusion　The PCR-SSCP method can be used in the pedigree analysis of FH probands.The early diagnosis of siblings and relatives can help to provide genetic consultation and direction so as to pay attention to development of hypercholesterolemia.

　　【Key words】　familial hypercholesterolemia;　polymerase chain reaction-single strain conformation polymorphism;　pedigree analysis

　　家族性高胆固醇血症(familial hypercholes-tolemia,FH)是一种较为常见的常染色体显性遗传疾病，是冠心病的一种重要危险因素，对其病因即低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDL-R)基因突变的研究具有重要意义。我们应用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)结合DNA序列测定从基因水平检出4例FH患者，并应用PCR-SSCP对这些患者家系成员进行了检查研究。

　　1　对象和方法

　　1.1　研究对象　4例FH患者(经PCR-SSCP筛查、DNA序列分析证实)及其家系成员共23例。

　　1.2　实验方法　对每例FH患者采集其家系成员的外周静脉血，再进行该突变所在外显子的PCR-SSCP分析，根据SSCP的带型即可进行家系分析。

　　1.2.1　DNA的提取　采用酚、氯仿法从白细胞中提取基因组DNA。

　　1.2.2　血脂分析　总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)和高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)的测定采用标准酶法，载脂蛋白(apolipoprotein,apo)AI和apoB的测定采用免疫比浊法，低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)(mg/dl)=TC-HDL-C-1/5TG。

　　1.2.3　PCR引物及反应条件　4例FH患者中，1例纯合子外显子7发生点突变，1例杂合子点突变位于外显子14，2例杂合子点突变位于外显子4的3′部分。引物序列为外显子4(3′部分)5′-CGACTGCGAAGA-TGGCTCGGA-3′，5′-ACGCCCCGCCCCCACCCTG-CCCCGC-3′；外显子7：5′-AGTCTGCATCCCTGGC-CCTGCGCAG-3′，5′-AGGGCTCAGTCCACCGGG-GAATCAC-3′；外显子14：5′-CCTGACTCCGCTTC-TTCTGCCCCAG-3′，5′-ACGCAGAAACAAGGCG-TGTGCCACA-3′。PCR反应总体积为30 μl，包括：1 μg基因组DNA，125 μmol/L dNTPs，200 pmol/L引物，10×buffer,1.50 mmol/L MgCl2，1U Taq DNA聚合酶。PCR反应程序：预变性为95℃ 5 min，然后进入循环，变性95℃ 1 min，退火68℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，循环30次，最后延伸72℃ 7 min。

　　1.2.4　单链构象多态性分析(SSCP)　6 μl扩增产物与2倍体积的变性液(95%去离子甲酰胺，10 mmol/L EDTA pH8.0，0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯氰蓝)混合。95℃变性5～10 min，冰中骤冷。用一般的夹心式垂直电泳槽进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度49∶1)电泳，4℃ 180V电泳3 h左右。凝胶的硝酸银染色：固定液(10%乙醇，0.5%冰醋酸)固定10 min，染色(0.2%硝酸银)15 min，显色(1.5%氢氧化钠，0.4%甲醛)大约20 min至条带清楚而背景不至过深，0.75%无水碳酸钠终止反应，每一步骤之间用去离子水冲洗2遍。

　　2　结果

　　2.1　家系1　见图1a。共11人，先证者(Ⅱ4)为杂合子FH患者，外显子4的3′部分发生了点突变，其与正常个体的SSCP带型明显不同，多出1条单链带，见图1b。用PCR-SSCP对该家系进行分析，结果：Ⅰ2、Ⅱ2、Ⅱ3及Ⅲ4也是突变杂合子，其余6个家系成员均正常，故先证者的突变来自其母亲。

　　2.2　家系2　见图2。共5人，先证者(Ⅱ1)为纯合子FH患者，外显子7发生了点突变，其家系成员及正常个体SSCP带型可见突变纯合子单链带型与正常对照明显不同，突变杂合子单链型介于突变纯合子与正常对照之间。PCR-SSCP对该家系分析，结果：先证者的父、母均为杂合子，胞弟亦为纯合子，胞妹正常。

　　2.3　家系3　见图3。共5人，先证者(Ⅰ2)为杂合子FH患者，外显子4的3′部分发生点突变，其SSCP带型与家系1先证者相同，见图1b。先证者将突变遗传给其女儿和外孙，而其儿子未受累。

　　2.4　家系4　见图4a。共3人，先证者(Ⅰ1)为杂合子，点突变发生于外显子14，其家系SSCP带型，突变杂合子的带型与正常对照明显不同，多出1条单链带(图4b)。先证者的女儿正常。

　　2.5　4个FH家系基因突变与血脂水平之间的关系见表1。家系2中的2例纯合子年龄只有11～13岁。TC、LDL-C水平显著升高，杂合子患者与正常个体之间TC、LDL-C水平有统计学差异(TC分别为7.71±2.13 mmol/L和4.38±0.96 mmol/L，LDL-C分别为6.11±2.09 mmol/L和2.76±0.93 mmol/L，t检验均P＜0.001)，说明LDL-R基因突变与临床表型是共分离的。仅有1例杂合子患者TC在5.2 mmol/L以下。

图1　家系1(a)及外显子4的3′部分SSCP带型(b)　图2　家系2(a)及外显子7的SSCP带型(b)　图3　家系3　图4　家系4(a)及外显子14的SSCP带型(b)　图1～4图中N：正常对照；Ho：突变纯合子；He：突变杂合子；SS：单链；DS：双链；ASS：异常单链带

　　Fig 1　Family 1 (a) and SSCP pattern of 3′part of exon 4(b)　Fig 2　Family 2 (a) and SSCP pattern of exon 7(b)　Fig 3　Family 3　Fig 4　Family 4 (a) and SSCP(b) pattern of exon 14　Fig1-4. N:normal control; Ho:homozygote;He:heterozygote;SS:single strand;DS:double strand; ASS:abhormal single strand

表1　各家系成员血脂水平

　　Table 1　Lipid values of individuals in four families

Pedigree
(家系)
 Number
(成员)
 Sex

(性别)
 Age(year)
(年龄)

(岁)
 TC
(mmol/L)
 LDL-C

(mmol/L)
 TG
(mmol/L)
 HDL

(mmol/L)
 apoAI

(mg/dl)
 apoB
(mg/dl)
 apoAI/apoB Mutation
(突变)
 
1 Ⅱ4 male 40 6.99 5.43 1.36 0.93 96.7 146.6 0.66 +
Ⅲ4 female 14 6.88 5.17 1.50 0.99 94.6 126.9 0.75 +
Ⅱ3 male 28 10.43 8.45 2.18 0.95 98.7 215.3 0.46 +
Ⅰ2 female 63 6.62 4.88 1.23 1.15 114.4 117.5 0.97 +
Ⅱ2 male 34 7.88 6.53 1.21 0.78 85.4 168.5 0.51 +
Ⅱ5 female 39 4.40 2.11 0.76 1.93 152.9 52.3 2.92 -
Ⅲ3 male 5 4.28 2.50 0.61 1.49 124.8 63.2 1.97 -
Ⅱ1 female 33 3.81 2.34 1.28 0.87 113.4 76.8 1.48 -
Ⅲ1 male 10 3.65 2.24 0.87 1.01 107.1 63.6 1.68 -
Ⅲ2 male 5 3.57 2.03 0.86 1.13 105.0 54.4 1.93 -
Ⅰ1 male 65 5.44 3.94 1.25 0.90 102.0 95.7 1.07 -
2 Ⅰ1 male 38 6.59 5.02 1.12 1.06 104.0 88.4 1.18 +
Ⅰ2 female 37 4.92 3.50 0.77 1.07 98.3 62.8 1.57 +
Ⅱ1 male 13 19.42 17.74 2.62 0.49 56.1 302.0 0.19 ++
Ⅱ2 male 11 12.83 10.91 3.18 0.48 50.2 219.0 0.23 ++
Ⅱ3 female 8 3.00 1.61 0.65 1.09 88.8 43.2 2.06 -
3 Ⅰ1 female 57 12.27 10.79 1.33 0.86 81.9 207.0 0.40 +
Ⅱ2 female 38 8.10 6.16 2.45 0.79 96.7 165.0 0.59 +
Ⅲ1 male 12 5.52 4.10 0.49 1.19 130.0 97.8 1.33 +
Ⅱ1 male 36 6.16 4.54 1.49 0.91 91.8 133.0 0.69 -
Ⅱ3 male 38 4.41 2.81 0.93 1.16 148.0 82.6 1.79 -
4 Ⅰ1 male 70 8.63 7.15 1.12 0.95 85.2 155.0 0.55 +
Ⅱ1 female 40 5.08 3.43 1.65 0.96 86.8 98.4 0.88 -

　　++：homozygote(纯合子)；+：heterozygote(杂合子)；-：normal zygote(正常基因型)；male(男性)；female(女性)3　讨论

　　FH属脂蛋白代谢异常分类中的ⅡA型高脂血症。杂合子在大多数人群中的发病率为1/500，纯合子约为百万分之一，病情严重，常在青少年时期死于致命性的冠心病［1］。大多数FH患者的诊断是根据临床表现、生化指标以及有冠心病和高脂血症家族史。然而，并不是所有杂合子患者都符合诊断标准，有些血脂水平可在正常范围或尚未开始升高；有些高胆固醇血症也可是多个环境因素和遗传因素相作用的结果，因此只根据临床表现难以作出明确诊断［2］。对FH的病因即LDL-R基因突变的研究很重要，可从基因水平明确诊断；对一些患者能在血脂升高之前就明确诊断，这可以避免或减少疾病进展到晚期；基因水平的诊断也可以对先证者家系的后代提供咨询。

　　目前已发现150多种不同突变，突变有着显著的多样性和明显的地区差异［3］。在某些地区社会和地理因素导致这些人群从遗传学角度是分离的，因此由于“奠基基因”效应［4］，一种或几种突变占了大多数。在这样的人群中，基因筛查和基因诊断较为简单。而在大多数地区中，不存在奠基基因效应，家系分析方法对于早期发现FH患者起了很大的作用。我们采用PCR-SSCP方法来研究LDL-R基因的点突变，对于基因诊断证实的FH患者，应用PCR-SSCP分析其家系成员，结果表明，采用PCR-SSCP可对先证者家系的成员明确诊断，并对其后代早期诊断，提供咨询和指导。

　　Moorjani等［5］对于纯合子FH患者的研究证实，LDL-R基因突变对其临床表现有着显著的影响；而对杂合子FH患者，这种影响不是很显著。家系2各成员的血脂水平也证实了这一点。这表明仅有单拷贝突变基因时，其他因素影响也起着一定的作用。在家系1中，基因突变与高胆固醇血症是共分离的，但是在不同突变个体之间，血脂异常的程度也是变异的，推测或许有其他遗传或环境因素在调节其临床表现。家系3成员Ⅲ1，单纯根据其血脂水平很难作出FH的诊断，通过家系分析，我们从基因水平对其明确诊断，从而可进行早期干预。

　　基金项目：国家自然科学基金(39670312)

　　作者单位：徐义枢（100037北京，中国医学科学院 中国协和医科大学 阜外心血管病医院心血管病研究所冠心病研究室）

　　孙继良（100037北京，中国医学科学院 中国协和医科大学 阜外心血管病医院心血管病研究所冠心病研究室）

　　杨跃进（100037北京，中国医学科学院 中国协和医科大学 阜外心血管病医院心血管病研究所冠心病研究室）

　　陈纪林（100037北京，中国医学科学院 中国协和医科大学 阜外心血管病医院心血管病研究所冠心病研究室）

　　高润霖（100037北京，中国医学科学院 中国协和医科大学 阜外心血管病医院心血管病研究所冠心病研究室）

　　许海燕（100037北京，中国医学科学院 中国协和医科大学 阜外心血管病医院心血管病研究所冠心病研究室）

　　陈保生（基础医学研究所）

　　吕新跃（基础医学研究所）

　　曾武威（基础医学研究所）

　　杜怀明（天津医科大学附属医院儿科）

　　马咸成（天津医科大学附属医院儿科）

　　参考文献

　　［1］Thompson GR. Plasma exchange in the management of homozygous familial hypercholesterolemia. Lancet, 1975,1(5)∶1208-1211.

　　［2］Kessing AM, Seed M, Taylor R, et al.Rising cholesterol levels in children with familial hypercholesterolemia. Biomed Pharmacother, 1990,44(7)∶373-379.

　　［3］Sun XM, Webb JC, Gudnason V, et al.Characterization of deletions in the low density lipoprotein receptor gene in patients with familial hypercholesterolemia in the United Kingdom. Arterio Thromb, 1992,12(7)∶762-770.

　　［4］Jenson HK, Jensen LG, Hansen PS, et al.The Trp23-stop and Trp66-Gly mutations in the low density lipoprotein receptor gene:common causes of familial hypercholesterolemia in Denmark. Atherosclerosis,1996,120(1-2)∶57-65.

　　［5］Moorjani S, Roy M, Torres A, et al.Mutations of the low-density-lipoprotein-receptor gene, variation in plasma cholesterol, and expression of coronary heart disease in homozygous familial cholesterolemia. Lancet, 1993,341(8856)∶1303-1306.